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玉米大斑病菌cDNA文库的构建及转录因子StMR1互作蛋白的筛选

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生物技术通报 2024年第6期40卷 281-289页

作者：王秋月段鹏亮李海笑刘宁曹志艳董金皋河北农业大学植物保护学院保定071000 华北作物改良与调控国家重点实验室保定071000

【目的】筛选玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)转录因子的互作蛋白,解析黑色素调控转录因子StMR1调控玉米大斑病菌致病性的分子机制。为解析玉米大斑病菌侵染过程中转录因子的调控网络,阐明病菌的致病机理提供参考。【方法】收集玉... 详细信息

【目的】筛选玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)转录因子的互作蛋白,解析黑色素调控转录因子StMR1调控玉米大斑病菌致病性的分子机制。为解析玉米大斑病菌侵染过程中转录因子的调控网络,阐明病菌的致病机理提供参考。【方法】收集玉米大斑病菌菌丝和孢子不同萌发阶段作为试验材料,采用Gateway方法构建玉米大斑病菌cDNA文库,使用同源重组的方法构建转录因子StMR1的诱饵载体,采用酵母双杂交技术筛选其互作蛋白并进行一对一验证。【结果】构建的玉米大斑病菌文库插入的平均片段长度大于1000 bp,初级文库及次级文库的库容量为1.2×107和1.04×107CFU,重组率为100%,可以用于酵母双杂交筛选。成功构建可以用于筛库的诱饵载体pGBKT7-StMR1,经初筛与复筛得到3个互作蛋白,一对一验证短链脱氢酶、糖基转移酶、富含亮氨酸重复序列蛋白均与转录因子StMR1存在互作。【结论】成功构建了丰富度高且质量好的玉米大斑病菌cDNA文库并筛选到了与转录因子StMR1互作的蛋白。

关键词：玉米大斑病菌 cDNA文库转录因子酵母双杂交互作蛋白

中国北方玉米产区玉米大斑病菌交配型组成及其分布分析

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农业生物技术学报 2024年第5期32卷 1141-1149页

作者：王超红张璐郭正宇阎晓光刘欣芳刘宁曹志艳董金皋河北农业大学植物保护学院/华北作物改良与调控国家重点实验室山西农业大学玉米研究所山西农业大学谷子研究所辽宁省农业科学院玉米研究所

玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)可危害玉米(Zea mays)叶片、叶鞘和苞叶等，导致玉米产量降低和品质下降，进而造成严重的经济损失，玉米大斑病已成为我国玉米上最重要的真菌病害之一。玉米大斑病菌有3种交配类型(mating type, MAT... 详细信息

玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)可危害玉米(Zea mays)叶片、叶鞘和苞叶等，导致玉米产量降低和品质下降，进而造成严重的经济损失，玉米大斑病已成为我国玉米上最重要的真菌病害之一。玉米大斑病菌有3种交配类型(mating type, MAT)，分为仅含StMAT1-1基因的A交配型、仅含StMAT1-2基因的a交配型和同时含有2个基因的Aa交配型。在我国，玉米大斑病菌交配型组成及分布在年度和地域间存在明显差异，导致病菌遗传变异频繁。为明确中国北方玉米产区不同年份该病菌交配型组成及其分布，本研究利用玉米大斑病菌交配型鉴定特异引物对2018～2022年间采自中国陕西、山西、河南、河北、甘肃、黑龙江、宁夏、内蒙古、辽宁、吉林10个省份(自治区)的365株玉米大斑病菌进行交配型测定。结果显示A交配型菌株61株、a交配型菌株224株和Aa两性交配型菌株80株，分离频率分别为16.71%、61.37%和21.92%，说明a交配型为我国北方玉米产区的主要交配型；不同年份间玉米大斑病菌群体交配型的出现频率差异不大，a交配型在2018、2019、2020、2021、2022年的分离频率分别为61.73%、72.50%、55.74%、58.65%和63.29%，均为优势交配型。不同地区玉米大斑病菌交配型组成存在差异，在黑龙江省未分离到A交配型菌株，其余9个省份(自治区)均有A、a和Aa 3种交配类型的分布，但各地区间不同交配型菌株的分布频率存在差异，a交配型的菌株在黑龙江省出现频率最高，为87.50%,A交配型的菌株在陕西省出现频率最高，为26.67%,Aa交配型的菌株在内蒙古和吉林省出现频率最高，均为33.33%，表明玉米大斑病菌群体交配型存在多样性。本研究进一步阐明了中国北方玉米产区大斑病菌交配型组成与分布情况，为病菌变异趋势分析及有效防治提供了借鉴。

关键词：玉米大斑病菌交配型(MAT) 分布

玉米大斑病菌铁载体合成基因簇鉴定及表达分析

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农业生物技术学报 2024年第5期32卷 1121-1131页

作者：岳浩峰赵天益李海笑闫秋静徐雅迪孟亚南曹志艳刘宁董金皋河北农业大学生命科学学院华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省植物生理与分子病理学重点实验室河北农业大学植物保护学院

铁是微生物生长必需的元素，在氧代谢、电子转移以及DNA和RNA合成等过程中发挥重要作用，微生物主要依赖于铁载体吸收环境中的铁离子。铁载体作为微生物分泌的低分子量铁螯合物，协助机体运输铁离子。真菌主要利用非核糖体多肽合成酶编... 详细信息

铁是微生物生长必需的元素，在氧代谢、电子转移以及DNA和RNA合成等过程中发挥重要作用，微生物主要依赖于铁载体吸收环境中的铁离子。铁载体作为微生物分泌的低分子量铁螯合物，协助机体运输铁离子。真菌主要利用非核糖体多肽合成酶编码基因为核心的次级代谢物生物合成基因簇合成铁载体，本研究旨在明确玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)铁载体的合成基因簇以及关键基因的表达。利用铬天青(chrome azurol sulphonate, CAS)鉴定玉米大斑病菌合成铁载体的类型并利用AntiSMASH网站预测其生物合成基因簇，利用玉米大斑病菌孢子不同发育时期的转录组数据及qRT-PCR分析病菌侵染过程中铁载体合成基因簇中各关键基因的表达水平以及外源铁浓度对基因表达的影响。结果表明，玉米大斑病菌产生异羟肟酸盐型铁载体，在基因组中鉴定得到1个产生异羟肟酸盐铁载体的次级代谢物生物合成基因簇，由非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)编码基因StNPS6为核心的12个铁载体合成相关基因组成。在玉米大斑病菌孢子萌发和侵染玉米叶片的过程中，基因簇中多个基因表达显著上调。与菌丝时期相比，侵染6 d后StNPS6表达量上调5.52倍，侵染9 d时后辅助合成基因StrhbE表达量上调24.12倍，编码转运相关蛋白的基因Stpmd1上调19.95倍。同时发现富铁和贫铁均对病菌的生长具有一定的抑制作用，且富铁情况下病菌黑色素合成受阻，培养基中铁含量差异导致基因簇中多个基因表达量显著变化，尤其是转运相关蛋白基因Stpmd1在富铁条件下表达量上升73.28倍。本研究为解析玉米大斑病菌铁载体的潜在作用提供了参考。

关键词：玉米大斑病菌铁载体次级代谢产物生物合成基因簇基因表达

泛在学习模式在大学英语教学中的应用策略——以中国文化英语听说课程为例

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英语广场（学术研究） 2022年第17期 101-104页

作者：曹志艳长沙理工大学外国语学院

信息技术对高等教育的深度渗透正在催生教学手段、教学方法和教学模式的变革。本文以大学英语后续课程——中国文化英语听说课程为例,探讨如何顺应泛在学习环境,运用信息技术实现大学英语教学的结构调整、内容优化、方法改进、特色凸显... 详细信息

信息技术对高等教育的深度渗透正在催生教学手段、教学方法和教学模式的变革。本文以大学英语后续课程——中国文化英语听说课程为例,探讨如何顺应泛在学习环境,运用信息技术实现大学英语教学的结构调整、内容优化、方法改进、特色凸显,以实现“以教为主”转向“以学为主”,“以课堂为主”转向“课内外结合”,“以知识传授为主”转向“以能力培养及素质提升为主”,促进个性化自主学习和协作教学。

关键词：泛在学习大学英语教学策略

玉米大斑病菌小柱孢酮脱水酶StSCD家族鉴定及其功能分析

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中国农业科学 2022年第16期55卷 3134-3143页

作者：郝玉彬李海笑张赛刘宁刘英姿曹志艳董金皋河北农业大学植物保护学院河北省承德市园林管理中心华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省植物生理与分子病理学重点实验室

【目的】小柱孢酮脱水酶（scytalone dehydratase,SCD）是黑色素合成过程中的关键酶。本文旨在鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小柱孢酮脱水酶基因（StSCD）家族，并分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StSCD基因家族表达量差异... 详细信息

【目的】小柱孢酮脱水酶（scytalone dehydratase,SCD）是黑色素合成过程中的关键酶。本文旨在鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小柱孢酮脱水酶基因（StSCD）家族，并分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StSCD基因家族表达量差异及SCD抑制剂对黑色素合成的影响，为进一步研究StSCD基因家族在黑色素合成和附着胞发育中的作用打下基础。【方法】利用玉米大斑病菌野生型菌株01-23的全基因组数据，获得StSCD基因家族的全序列，并与玉米小斑病菌（Cochlibolus heterostrophus）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、瓜类炭疽病菌（Colletotrichum lagenaria）等真菌的SCD进行序列比对；收集玉米大斑病菌附着胞不同发育时期的材料进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析，获得不同时期、不同StSCD的表达量，从而确定与病菌侵染和附着胞黑色素化密切相关的脱水酶基因；使用SCD抑制剂环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌，测定菌落生长速度、黑色素合成量、附着胞膨压等，确定StSCD在附着胞发育过程中的作用。【结果】玉米大斑病菌全基因组中共鉴定到4个StSCD，其编码蛋白具有SCD保守结构域及保守的催化及底物结合氨基酸残基。StSCD3与灰葡萄孢（Botrytis cinerea）中功能冗余的SCD2蛋白具有较高同源性，StSCD4与多主棒孢（Corynespora cassiicola）中参与黑色素合成的SCD蛋白具有较高同源性。通过分析玉米大斑病菌生长发育过程中不同时期StSCD的表达量发现，在附着胞时期4个StSCD表达量均上调，其中StSCD3、StSCD4表达量上调尤为显著，附着胞再生菌丝时期StSCD3、StSCD4的表达量均显著下降，并且在附着胞诱导整个时期StSCD4的表达量较高。环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌后，黑色素合成受阻，附着胞膨压显著降低。【结论】玉米大斑病菌含有4个StSCD，推测StSCD4参与DHN(1,8-间苯二酚)黑色素的合成，并进而影响附着胞膨压积累。

关键词：玉米大斑病菌 StSCD家族黑色素环丙酰菌胺

拟轮枝镰孢与玉米籽粒互作的差异基因筛选及代谢通路分析

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中国农业科学 2023年第6期56卷 1086-1101页

作者：渠清刘宁邹金鹏张雅璇贾慧孙蔓莉曹志艳董金皋河北农业大学生命科学学院河北省植物生理与分子病理学重点实验室/华北作物改良与调控国家重点实验室河北农业大学植物保护学院

【目的】拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)引起的玉米穗腐病是我国玉米产区发生严重的病害之一，论文旨在了解病原菌与玉米籽粒互作过程中的基因表达差异，为揭示病原菌的致病机制和玉米抗病机制提供依据。【方法】对拟轮枝镰孢侵... 详细信息

【目的】拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)引起的玉米穗腐病是我国玉米产区发生严重的病害之一，论文旨在了解病原菌与玉米籽粒互作过程中的基因表达差异，为揭示病原菌的致病机制和玉米抗病机制提供依据。【方法】对拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒0、4、12和72 h的样品进行转录组测序，之后采用生物信息学分析，分别以玉米和拟轮枝镰孢基因组为参考，以|log2FC|≥1,P-adjust<0.05为阈值筛选互作过程中玉米和拟轮枝镰孢的差异表达基因，利用GO和KEGG对其进行功能注释及富集分析。Goatools软件分析植物-病原互作、MAPK途径和植物激素信号转导通路相关差异基因的表达变化，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对测序差异基因进行验证。【结果】在互作4、12和72 h后拟轮枝镰孢分别有140、400和1 945个基因上调表达，有9、302和1 784个基因下调表达；玉米分别有293、692和1 426个基因上调表达，320、482和153个基因下调表达。GO和KEGG富集分析显示，侵染早期拟轮枝镰孢在细胞间隙生长，差异基因主要富集在RNA生物合成、细胞壁结构成分、脂肪酸生物合成、蛋白质代谢、碳水化合物代谢、生物过程和代谢过程等通路中。拟轮枝镰孢早期侵染触发了玉米活性氧(ROS)爆发，差异基因主要富集在对活性氧、过氧化氢的反应，几丁质酶、单加氧酶活性，木质素代谢过程等相关通路中。侵染后期拟轮枝镰孢继续在籽粒中定殖及扩展，差异基因主要富集在碳水化合物和细胞壁多糖分解代谢过程、跨膜转运、氧化还原酶活性等功能通路中。玉米主要通过苯丙素、木质素、类黄酮生物合成，MAPK信号通路、植物-病原互作和植物激素信号转导等途径差异基因大量表达响应病原菌侵染。随机选取6个玉米和6个拟轮枝镰孢的差异表达基因进行qRT-PCR分析，基因表达规律与转录组测序结果一致，证实了RNA-seq的准确性。【结论】在病原菌侵染早期，拟轮枝镰孢在细胞间隙生长，触发玉米活性氧爆发，相关通路差异基因表达；侵染中后期，病原菌以淀粉为营养素，继续在籽粒中定殖及扩展，玉米通过苯丙素、木质素及几丁质酶的生物合成等方面的相关基因表达响应拟轮枝镰孢侵染，同时植物-病原互作、MAPK途径和激素信号转导等途径参与抗拟轮枝镰孢侵染。

关键词：拟轮枝镰孢玉米穗腐病转录组植物-病原互作基因表达差异表达基因

基于非靶向代谢组学分析StLAC2和StLAC6差异影响玉米大斑病菌的机制

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中国农业科学 2023年第16期56卷 3110-3123页

作者：邹金鹏岳浩峰李海笑刘峥刘宁曹志艳董金皋河北农业大学植物保护学院河北省植物生理与分子病理学重点实验室/华北作物改良与调控国家重点实验室保定市教育科学研究所

【背景】漆酶作为多酚氧化酶，在真菌生长发育及次级代谢等多方面发挥重要的作用。玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）基因组中含有多个漆酶基因，其中StLAC2和StLAC6对玉米大斑病菌生长发育及致病性具有差异的影响。【目的】明确StL... 详细信息

【背景】漆酶作为多酚氧化酶，在真菌生长发育及次级代谢等多方面发挥重要的作用。玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）基因组中含有多个漆酶基因，其中StLAC2和StLAC6对玉米大斑病菌生长发育及致病性具有差异的影响。【目的】明确StLAC2和StLAC6对玉米大斑病菌的差异作用机制，挖掘差异代谢物，为开发新的杀菌剂及病害防控新策略提供靶点。【方法】利用无缝克隆的方法将StLAC6和pHZ100-GFP质粒连接，构建StLAC6的回补表达载体。利用PEG介导的原生质体转化法，将构建好的载体转入到StLAC6基因缺失突变体的原生质体中，并利用PCR、RT-qPCR和GFP荧光验证，对所获得的阳性转化子进行鉴定，成功构建StLAC6回补菌株，并分析敲除及回补StLAC2和StLAC6对玉米大斑病菌胞内外黑色素合成及抗氧化性的影响。以野生型、StLAC2和StLAC6基因敲除突变体为试验材料，利用非靶向代谢组学分析其差异代谢物，并利用KEGG分析StLAC2和StLAC6差异作用的机制。【结果】StLAC2和StLAC6对病菌菌丝内和分泌到培养基中的黑色素合成具有差异影响，且StLAC2影响病菌的抗氧化性。代谢组分析发现与玉米大斑病菌野生型菌株相比，敲除StLAC2后无论菌丝中或分泌到培养基中的差异代谢物数量更多，KEGG分析发现差异代谢物主要为脂类尤其是磷脂，StLAC2的缺失造成多种黄酮多酚类代谢物下调。而1,8-二羟基萘型黑色素合成途径的中间代谢物小柱孢酮和柱孢酮含量在ΔStLAC2中显著增加，在ΔStLAC6中显著降低。【结论】StLAC2参与黑色素的聚合，StLAC6负调控玉米大斑病菌黑色素合成，StLAC2和StLAC6差异影响玉米大斑病菌中脂类代谢物和黑色素合成途径的中间代谢物，StLAC2缺失造成多种黄酮多酚类代谢物下调，导致抗氧化性降低。

关键词：玉米大斑病菌漆酶代谢组学差异代谢物黑色素

拟轮枝镰孢和禾谷镰孢Hsp70基因家族鉴定及其在不同温度下的表达模式

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农业生物技术学报 2022年第12期30卷 2407-2416页

作者：陈悦李海笑刘峥刘宁孙蔓莉曹志艳董金皋河北农业大学生命科学学院河北省植物生理与分子病理学重点实验室/华北作物改良与调控国家重点实验室河北农业大学植物保护学院保定市教育科学研究所

拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)、禾谷镰孢(F. graminearum)是引起玉米(Zea mays)茎腐病和穗腐病等病害的主要致病菌，可造成玉米产量和品质的下降，并影响机械化收获，同时病菌产生的真菌毒素会给人和家畜的健康带来严重威胁。... 详细信息

拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)、禾谷镰孢(F. graminearum)是引起玉米(Zea mays)茎腐病和穗腐病等病害的主要致病菌，可造成玉米产量和品质的下降，并影响机械化收获，同时病菌产生的真菌毒素会给人和家畜的健康带来严重威胁。热激蛋白(heat shock proteins, HSP)可以在生物体处于环境压力时大量表达从而防止蛋白质变性来提高生物体对各种逆境的抵抗力，目前Hsp70是最保守且研究较为广泛的一类热激蛋白。为探究拟轮枝镰孢及禾谷镰孢生长是否受温度的调控，本研究把生长期一致的拟轮枝镰孢和禾谷镰孢接种到培养基上，分别放置于20、25与30℃的培养箱中培养，发现拟轮枝镰孢30℃时生长迅速，菌丝茂密，而禾谷镰孢20℃时生长更好。为进一步明确Hsp70基因家族是否参与调控温度胁迫下拟轮枝镰孢和禾谷镰孢的生长发育，本研究通过全基因组搜索，在拟轮枝镰孢基因组中鉴定获得了9个Hsp70基因，在禾谷镰孢基因组中鉴定得到了6个Hsp70基因，利用qPCR技术检测了生长在20、25和30℃条件下的拟轮枝镰孢和禾谷镰孢Hsp70基因家族的相对表达量。结果显示，拟轮枝镰孢Hsp70基因家族中的FvHsp70-2、FvHsp70-4、FvHsp70-5与FvHsp70-6基因在20℃的表达量显著升高(P<0.05)，尤其基因FvHsp70-2,20℃时的表达量约是30℃时的4.5倍；而禾谷镰孢中与FvHsp70-6亲缘关系近的FgHsp70-6、与FvHsp70-2亲缘关系近的FgHsp70-2、与FvHsp70-4亲缘关系近的FgHsp70-4及与FvHsp70-5亲缘关系近的FgHsp70-3在30℃时表达量显著升高(P<0.05)。以上结果说明，拟轮枝镰孢和禾谷镰孢中均存在响应逆境温度的Hsp70基因，由此建立的Hsp70家族基因在不同温度下的表达模式可为解析Hsp70基因家族响应温度变化调控拟轮枝镰孢及禾谷镰孢生长的分子机制提供理论依据。

关键词：拟轮枝镰孢禾谷镰孢热激蛋白70(Hsp70) 温度表达模式

具有辅助降解纤维素功能的大斑刚毛座腔菌糖苷水解酶GH61的鉴定、异源表达及功能分析

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生物技术通报 2023年第4期39卷 124-135页

作者：马玉倩孙东辉岳浩峰辛佳瑜刘宁曹志艳河北农业大学生命科学学院保定071000 河北农业大学植物保护学院保定071000 华北作物改良与调控国家重点实验室保定071000

糖苷水解酶61家族(GH61)属于一类同时具有氧化作用和水解作用的纤维素降解酶类,既具有微弱的纤维素内切酶活性,也可通过氧化作用破坏纤维素晶体结构促进纤维素酶对木质纤维素的降解,在生物质资源的利用方面具有潜在的应用价值。对大斑... 详细信息

糖苷水解酶61家族(GH61)属于一类同时具有氧化作用和水解作用的纤维素降解酶类,既具有微弱的纤维素内切酶活性,也可通过氧化作用破坏纤维素晶体结构促进纤维素酶对木质纤维素的降解,在生物质资源的利用方面具有潜在的应用价值。对大斑刚毛座腔菌Setosphaeria turcica的GH61家族基因进行鉴定及生物信息学分析,通过转录组数据分析及荧光定量PCR验证,筛选出受玉米秸秆木质纤维素底物诱导表达的GH61家族基因StGH61-11。将StGH61-11进行重组表达,使用2,6-二甲氧基苯酚氧化反应测定其酶活力并优化诱导条件,表征其酶学性质并检测其对纤维素酶水解木质纤维素的促进作用。结果表明,在S.turcica基因组中存在21个GH61家族基因,且S.turcica在玉米秸秆的诱导下滤纸酶活明显增加,对其进行转录组分析发现,在以玉米秸秆为碳源时GH61家族基因中有11个基因的表达量增加。将其中StGH61-11基因在大肠杆菌中诱导表达,最佳诱导条件为25℃、1 mmol/L IPTG诱导9 h,此时获得的蛋白比活力可达到(54.08±1.67)U/g。重组蛋白StGH61-11的最佳催化条件为温度50℃、pH 5,在最佳催化条件下可以显著提高纤维素酶水解玉米秸秆的活性,协同度最高可达2.5,糖化率最高可达46.5%。

关键词： GH61糖苷水解酶家族多糖单加氧酶纤维素酶 AA9 大斑刚毛座腔菌协同降解异源表达