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布鲁氏菌LPS合成相关重要蛋白的生物信息学分析及per基因的克隆表达

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基因组学与应用生物学 2022年第4期41卷 789-800页

作者：孙天浩易德武张倩李楠苗玉和王震陈创夫石河子大学动物科技学院石河子832000 西部地区高发人兽共患传染性疾病防治协同创新中心石河子832000 新疆农垦科学院石河子832000 福建圣维生物科技有限公司南平353000

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为布鲁氏菌(Brucella)重要毒力因子,在布鲁氏菌感染宿主过程中发挥重要作用。本研究通过对布鲁氏菌LPS合成相关重要蛋白进行生物信息学分析,并选择布鲁氏菌LPS O侧链关键基因per进行克隆表达,挖掘布鲁... 详细信息

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为布鲁氏菌(Brucella)重要毒力因子,在布鲁氏菌感染宿主过程中发挥重要作用。本研究通过对布鲁氏菌LPS合成相关重要蛋白进行生物信息学分析,并选择布鲁氏菌LPS O侧链关键基因per进行克隆表达,挖掘布鲁氏菌LPS功能及应用潜力。结果显示,布鲁氏菌LPS合成相关30个重要蛋白主要为无信号肽和跨膜螺旋结构的亲水性蛋白,均具有较强反应原性和甲基化及磷酸化修饰位点;其中18个蛋白(18/30)可发生糖基化修饰,4个蛋白(4/30)可发生乙酰化修饰;亚细胞定位显示,绝大多数蛋白在细胞质中发挥功能,少数在细胞周质及细胞内膜上发挥功能;除Wbpw蛋白外,布鲁氏菌LPS合成相关重要蛋白之间可发生相互作用;构建了pET28a-per重组表达质粒,经诱导在上清液中表达45.7 kDa蛋白,Western Blot验证该蛋白反应原性较强。本研究为布鲁氏菌LPS功能的后续研究及新型疫苗和诊断技术研发提供科学依据。

关键词：布鲁氏菌 LPS 生物信息学分析原核表达

布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspA、BspF的原核表达及布鲁菌免疫逃逸分析

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中华地方病学杂志 2016年第4期35卷 238-243页

作者：李默王远志易德武徐立业刘康张俊波陈创夫郭飞新疆石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室石河子832002 新疆石河子大学医学院动物科技学院预防兽医学教研室石河子832002 河北省邢台市刑台医学高等专科学校第二附属医院病理科邢台054000 河北省保定市第二中心医院骨科保定072750 贵州省铜仁学院生物与农林工程学院动物微生物学教研室铜仁554300

目的克隆并表达布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspA、BspF并推测其免疫逃逸机制。方法以羊种布鲁菌16M基因组为模板，利用PCR扩增布鲁菌分泌蛋白BspA（BAB1-0678）、BspF（BAB1-1948）基因，连接质粒pMD19-T后测序，将测序正确的基因片段... 详细信息

目的克隆并表达布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspA、BspF并推测其免疫逃逸机制。方法以羊种布鲁菌16M基因组为模板，利用PCR扩增布鲁菌分泌蛋白BspA（BAB1-0678）、BspF（BAB1-1948）基因，连接质粒pMD19-T后测序，将测序正确的基因片段经双酶切后克隆至pET-30a（＋）载体中，转化大肠埃希菌BL21（DE3），经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS—PAGE）和蛋白质免疫印迹（Western blot）分析鉴定表达产物；并与先天性免疫分子的蛋白序列进行比对分析。结果成功克隆了BspA、BspF基因，片段大小分别为576、1287bp；SDS—PAGE显示，BspA、BspF蛋白相对分子质量分别约为28×10^3、55×10^3；Western blot分析显示，BspA、BspF蛋白均可与布鲁菌阳性血清发生特异性反应，并且与先天性免疫分子白细胞介素1R（IL-1R）、髓样细胞分化因子88（MyD88）、Toll样受体2（TLR-2）、Toll样受体4（TLR-4）、单免疫球蛋白白介素1相关受体（SIGIRR）有同源性。结论成功获得了布鲁菌BspA、BspF蛋白，通过同源性分析，证明BspA、BspF蛋白在布鲁菌感染宿主过程中具有免疫逃逸的作用。研究结果为进一步研究布鲁菌的致病机制和揭示布鲁菌免疫逃逸机制提供了理论依据。

关键词：布鲁菌属蛋白质类 Ⅳ型分泌系统原核表达免疫逃逸

多模态人机交互在沉浸式食品安全教学培训中的应用研究

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多模态人机交互在沉浸式食品安全教学培训中的应用研究

作者：易心武江西师范大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌BMEII0988基因的克隆、原核表达及免疫原性分析

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生物技术 2017年第2期27卷 129-134,197页

作者：印双红张俊波易德武唐红李志强李默郭飞陈创夫铜仁学院大健康学院贵州铜仁554300 铜仁学院农林工程与规划学院(铜仁市文化科技产业创新研究中心) 贵州铜仁554300 浙江大学动物科技学院浙江杭州3100204 石河子大学动物科技学院新疆石河子832000 商丘师范学院生物与食品学院河南商丘476000 邢台市第二医院肝病二科河北邢台054000 石河子大学医学院新疆石河子832000

[目的]检测布鲁氏菌BMEII0988基因的原核表达情况并对其免疫原性进行分析。[方法]以热灭活的布鲁氏菌16M标准株为模板,根据Gen Bank中公布的羊种布鲁氏菌16M的BMEII0988基因序列分别设计引物,用PCR方法扩增BMEII0988基因的编码序列,连接... 详细信息

[目的]检测布鲁氏菌BMEII0988基因的原核表达情况并对其免疫原性进行分析。[方法]以热灭活的布鲁氏菌16M标准株为模板,根据Gen Bank中公布的羊种布鲁氏菌16M的BMEII0988基因序列分别设计引物,用PCR方法扩增BMEII0988基因的编码序列,连接到T载体测序,将测序正确的基因序列克隆到原核表达载体p ET-32a上,转化入大肠杆菌DE3感受态细胞中诱导表达,将获得的目标蛋白用AKTAxpress智能多维纯化系统进行纯化,并用Western Blot分析其反应原性。[结果]BMEII0988基因长度为1 131 bp,编码377个氨基酸,SDS-PAGE表明BMEII 0988融合蛋白在大约66 k Da处出现条带,纯化后条带单一,BMEII 0988蛋白(NCBI标准序列号:WP_002966326.1)具有较好的反应原性。[结论]该研究为下一步建立相应蛋白标记的诊断方法和疫苗的研发奠定了基础。

关键词：布鲁氏菌 BMEII0988基因原核表达

布鲁氏菌ManB蛋白的生物信息学分析及免疫原性研究

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农业生物技术学报 2018年第2期26卷 311-318页

作者：徐锦凤王震易德武童志霞王月丽陈创夫许志平新疆石河子大学生命科学学院新疆石河子大学动物科技学院

布鲁氏菌(Brucella)是一种革兰氏阴性兼胞内寄生菌,是多种动物和人布氏杆菌病的病原。布鲁氏菌磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase,man B)基因编码磷酸甘露糖变位酶,是布鲁氏菌毒力因子脂多糖的重要组成成分。为了研究布鲁氏菌毒力因... 详细信息

布鲁氏菌(Brucella)是一种革兰氏阴性兼胞内寄生菌,是多种动物和人布氏杆菌病的病原。布鲁氏菌磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase,man B)基因编码磷酸甘露糖变位酶,是布鲁氏菌毒力因子脂多糖的重要组成成分。为了研究布鲁氏菌毒力因子脂多糖的ManB蛋白的生物学功能和免疫原性,本文构建磷酸甘露糖变位酶manb基因原核表达载体,对ManB蛋白进行生物信息学预测分析并鉴定其免疫原性。采用PCR技术对布鲁氏菌manB基因进行特异性扩增,与pET-28a表达载体连接后转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot检测目的蛋白的表达及其反应原性,并通过小鼠(Mus musculus)免疫实验评价其免疫原性。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,不存在信号肽,二级结构以α-螺旋为主。利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。SDS-PAGE和Western blot结果表明获得了约56.3 k D的融合蛋白,且该融合蛋白与羊抗布鲁氏菌阳性血清可发生特异性反应。间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)结果显示,免疫小鼠7、14、21 d,实验组小鼠均可产生抗体,且随时间增加抗体水平也随之升高,并在免疫21 d后达到最高峰。ManB重组蛋白免疫小鼠后可诱导产生高水平的特异性抗体,具有良好的免疫原性。本研究结果为今后开发布鲁氏菌新型疫苗提供了新材料。

关键词：布鲁氏菌磷酸甘露糖变位酶(manB) 生物信息学免疫原性

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspB的原核表达及布鲁氏菌免疫逃逸分析

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中国病原生物学杂志 2015年第9期10卷 778-781,815页

作者：李默易德武王远志陈创夫于潞张俊波郭飞石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室新疆石河子832002 石河子大学动物科技学院新疆石河子832003 铜仁学院生物与农林工程学院贵州铜仁554300

目的克隆并表达布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspB并推测其免疫逃逸机制。方法以羊种布鲁氏菌16M基因组为模板,利用PCR扩增布鲁氏菌分泌蛋白BspB(BAB1-0712)基因,连接pMD19-T载体后测序,将测序正确的基因片段经双酶切后克隆至pET-30a载... 详细信息

目的克隆并表达布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspB并推测其免疫逃逸机制。方法以羊种布鲁氏菌16M基因组为模板,利用PCR扩增布鲁氏菌分泌蛋白BspB(BAB1-0712)基因,连接pMD19-T载体后测序,将测序正确的基因片段经双酶切后克隆至pET-30a载体中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果成功克隆了BspB基因,片段大小为564bp;SDS-PAGE检测,BspB蛋白分子质量单位约为27.5ku;Western blot分析显示,BspB蛋白均可被布鲁氏菌阳性血清识别。该蛋白测序后与先天性免疫分子IL-1R、MyD88、TLR-2、TLR-4、SIGIRR比对,具有一定的同源性。结论重组蛋白BspB具有免疫反应原性,可作为候选诊断抗原;由于其序列与IL-1R、MyD88、TLR-2、TLR-4及SIGIRR有一定同源性,BspB可能在布鲁氏菌感染宿主过程中发挥免疫逃逸的作用。

关键词：布鲁氏菌效应蛋白 Ⅳ型分泌系统原核表达免疫逃逸

布鲁氏菌GMD重组蛋白表达及对昆明系小鼠的免疫效果研究

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新疆农业科学 2017年第12期54卷 2304-2313页

作者：徐锦凤王震易德武易继海马旭升姬祥张辉陈创夫新疆石河子大学生命科学学院新疆石河子832000 新疆石河子大学动物科技学院新疆石河子832000

【目的】对布鲁氏菌GMD蛋白进行生物信息学预测分析和免疫原性研究,并在小鼠模型上评价其免疫效果。【方法】对GMD蛋白进行生物信息学分析,分析预测其结构及功能,采用PCR技术对布鲁氏菌gmd基因进行特异性扩增,与p ET-28a表达载体连接后... 详细信息

【目的】对布鲁氏菌GMD蛋白进行生物信息学预测分析和免疫原性研究,并在小鼠模型上评价其免疫效果。【方法】对GMD蛋白进行生物信息学分析,分析预测其结构及功能,采用PCR技术对布鲁氏菌gmd基因进行特异性扩增,与p ET-28a表达载体连接后转化至*** BL21(DE3)中,通过SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白的表达及其反应原性,并通过小鼠免疫和攻毒实验评价其免疫原性以及免疫保护力。【结果】生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,有15个抗原决定簇,不存在信号肽,二级结构以α-螺旋为主。并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。SDS-PAGE分析表明获得了约43.7 ku的融合蛋白,Western Blot结果显示该融合蛋白与羊抗布鲁氏菌阳性血清发生特异性反应。间接ELISA结果显示,免疫小鼠7、14、21 d,实验组小鼠均可产生抗体,且随时间增加抗体水平也随之升高。免疫保护力测定结果显示小鼠脾指数和脾脏CFU均低于PBS组。【结论】GMD重组蛋白具有良好的反应原性,其免疫小鼠后可诱导产生高水平的特异性抗体,具有良好的免疫原性;攻毒后能发挥一定免疫保护作用。

关键词：布鲁氏菌 AMD%重组蛋白免疫原性保护力

基于扩展状态观测器的PMLM预设时间滑模控制

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探测与控制学报 2024年

作者：殷春武赵紫兰易佩西安建筑科技大学信息与控制工程学院

对存在控制饱和、参数摄动和外部干扰的永磁直线电动机（Permanent Magnet Linear Motor，PMLM）位置跟踪误差收敛时间上界不可控的问题，设计了一种预设时间收敛滑模自适应控制器，使电机位置跟踪误差在预设时间内收敛，且电机转速一... 详细信息

对存在控制饱和、参数摄动和外部干扰的永磁直线电动机（Permanent Magnet Linear Motor，PMLM）位置跟踪误差收敛时间上界不可控的问题，设计了一种预设时间收敛滑模自适应控制器，使电机位置跟踪误差在预设时间内收敛，且电机转速一致有界。首先构造了一种预设时间收敛的滑模面；接着，采用双曲正切函数近似控制饱和约束，将双曲正切函数转换成关于无约束控制输入变量的线性函数，并采用二阶扩展状态观测器估计系统不确定部分，设计了一种滑模自适应控制器， Lyapunov稳定判据证明了闭环系统的预设时间稳定性。最后，含复合干扰的永磁直流电机位置阶跃跟踪数值仿真，验证了算法的有效性.仿真结果表明，电机位置跟踪误差在预设时间收敛内收敛，且位置跟踪精度高，对参数摄动和外部干扰具有强鲁棒性。

关键词：永磁直线电机滑模控制预设时间控制扩展状态观测器控制饱和

羊种布鲁氏菌新疆流行株015株sodc基因缺失株的构建与初步评价

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石河子大学学报（自然科学版） 2016年第1期34卷 24-29页

作者：易德武张俊波王远志李默李爽张欢王杰陈创夫石河子大学动物科技学院/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室新疆石河子832003 铜仁学院生物与农林工程学院贵州铜仁554300 石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室新疆石河子832002

为了构建布鲁氏菌015 sodc基因缺失株,本研究采用PCR方法以热灭活的羊种布鲁氏菌新疆流行株015为模板,分别扩增sodc基因的上下游同源臂序列;以枯草芽孢杆菌为模板,扩增Sac B基因,将扩增序列分别连至克隆载体p MD19-T simple上并测序,然... 详细信息

为了构建布鲁氏菌015 sodc基因缺失株,本研究采用PCR方法以热灭活的羊种布鲁氏菌新疆流行株015为模板,分别扩增sodc基因的上下游同源臂序列;以枯草芽孢杆菌为模板,扩增Sac B基因,将扩增序列分别连至克隆载体p MD19-T simple上并测序,然后在双酶切后将上下游同源臂序列连接至自杀载体p GEM-7Zf+上,分别得到了p GEM-7zf-Δsodc,再将Sac B基因单酶切后连接至上述载体上,构建成同源重组自杀质粒pss。经8%蔗糖平板筛选鉴定Sac B基因的活性。将构建好的自杀质粒分别电转化至布鲁氏菌015感受态细胞中,通过氨苄抗性筛选和8%蔗糖敏感筛选后获得了015Δsodc基因缺失株。对获得的基因缺失株进行PCR鉴定和遗传稳定性检测。通过检测侵染小鼠巨噬细胞cfu、缺失株免疫小鼠后体内Ig G,IFN-γ的水平,及脾脏cfu,对其毒力进行了初步评价。结果表明,该缺失株20代内未发生回复性突变,成功构建了具有非抗性基因标记的缺失株,并且015Δsodc细胞cfu、脾脏cfu,及IFN-γ的水平都显著低与亲本株015,说明毒力与亲本株相比有一定程度的下降。本研究可为今后布鲁氏菌致病机理及新疫苗的研究提供实验材料。

关键词：布鲁氏菌 sodc基因缺失株