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sp3111转基因RNAi小鼠模型的建立及其表型分析

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sp3111转基因RNAi小鼠模型的建立及其表型分析

作者：时伟丽复旦大学

学位级别：硕士

sp3111基因是本实验室筛选鉴定的一种配子特异性表达基因,SP3111蛋白最初被发现仅在大鼠精子顶体表达,故命名为大鼠精子特异性表达蛋白(rat sperm specific protein 3111, SP3111),并根据其氨基酸序列推导SP3111蛋白是一个具有四次跨膜... 详细信息

sp3111基因是本实验室筛选鉴定的一种配子特异性表达基因,SP3111蛋白最初被发现仅在大鼠精子顶体表达,故命名为大鼠精子特异性表达蛋白(rat sperm specific protein 3111, SP3111),并根据其氨基酸序列推导SP3111蛋白是一个具有四次跨膜结构的膜蛋白。随后在小鼠中发现SP3111蛋白主要分布在精子顶体部位、卵细胞膜及受精卵膜上,推测其为配子特异性表达膜蛋白。在前期进行的体外抗体封闭实验中观察到,用抗SP3111特异性抗体Ab2438处理小鼠精子及受精卵后,能明显降低正常受精率并导致高“卵割”卵率,提示SP3111可能参与调控精卵间识别过程,并且在小鼠受精及早胚发育过程中起着重要作用。RNA干扰(RNAi)技术是在体或离体研究特定基因生物学功能的有效工具,已被广泛应用于生命科学研究。应用转基因技术,将表达靶基因特异性的shRNA“表达元件”整合到动物基因组中,产生转基因RNAi动物,该动物模型体内将不同程度地减少甚至缺失靶基因的表达,为基因功能研究、疾病模型构建以及基因治疗提供了新的平台。本研究中,我们应用转基因技术,成功构建了sp3111转基因RNAi小鼠模型,并已稳定遗传至F4代,为进一步在体研究SP3111在生殖过程中的功能奠定了基础。在获得sp3111转基因RNAi小鼠模型以后,我们首先通过Real-Time RT-PCR分析对其干扰效率进行评价,结果表明,sp3111转基因RNAi雄性小鼠7号家系sp3111mRNA的表达量与比野生雄性小鼠相比,降低了30%以上。其后,我们对sp3111转基因RNAi雄性小鼠的自然生育力进行检测分析,结果发现,与野生雄性小鼠相比,sp3111转基因RNAi雄性小鼠与同批次雌鼠交配后的后代窝仔数明显下降,提示SP3111蛋白表达量的下降可能会导致雄性个体生育力的下降。为了研究SP3111蛋白表达量下降对生育力影响的作用环节,我们用sp3111转基因RNAi雄性小鼠的精子进行体外受精实验,结果发现其正常受精率降低,而且受精后的“卵割”卵率也异常升高,与本实验室前期进行的体外抗体封闭实验结果相一致,进一步验证了SP3111蛋白可能在小鼠受精及早胚发育过程中发挥重要作用。综合以上研究结果,我们推测,SP3111蛋白作为配子特异表达的蛋白,可能在精、卵识别和受精过程,以及受精卵的早期发育过程中发挥重要作用;SP3111蛋白表达水平的降低会导致雄性个体生育力的下降。因此,对其在生殖过程中作用机制的深入研究将有助于对受精及早胚发育机制的认识,并可以为不育的治疗及新型避孕技术的发展提供新的思路和途径。

关键词：转基因RNAi SP3111 表型分析

第二代测序技术在一中国先天性白内障家系致病基因检测中的应用

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中华实验眼科杂志 2015年第8期33卷 705-709页

作者：肖海张卉李涛吴东张朝阳时伟丽秦利涛廖世秀郑州大学人民医院河南省人民医院河南省医学遗传研究所 450003

背景某些遗传性疾病具有高度遗传异质性,因此传统的Sanger测序技术已经不能满足医学研究及临床工作的需求.第二代测序（NGS）技术由于具有费用低及检测速度快的优点而得到广泛应用,但在先天性眼病突变基因的检测中的应用效果有待验证.... 详细信息

背景某些遗传性疾病具有高度遗传异质性,因此传统的Sanger测序技术已经不能满足医学研究及临床工作的需求.第二代测序（NGS）技术由于具有费用低及检测速度快的优点而得到广泛应用,但在先天性眼病突变基因的检测中的应用效果有待验证.目的探讨NGS技术对先天性白内障患者进行致病基因诊断和产前诊断的可行性.方法于2013年1月收集来自河南省洛阳市的一汉族先天性白内障家系,抽取家系中3例患者（Ⅱ2、Ⅲ3、Ⅲ4）和3名表型正常者（Ⅱ3、Ⅲ1、Ⅲ2）的外周血各2 ml,EDTA抗凝,在河南省医学遗传研究所应用NGS技术对先证者进行基因突变位点检测,并采用Sanger测序技术对NGS结果进行验证,然后用Sanger测序技术对该家系其他成员的外周血样本进行突变位点的序列分析,根据确定的致病突变位点对先证者的胎儿进行产前诊断.本研究遵循赫尔辛基宣言,检测方案经河南省人民医院医学伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书.结果该家系4代14位成员中共5例患者,其中男2例,女3例,分布于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ代中,其他家系成员表型正常,符合常染色体显性遗传方式.NGS检测发现先证者Ⅲ3CRYBB1基因第6外显子上存在c.682T＞C（p.S228P）杂合突变,Sanger法验证了该点突变.Sanger法检测发现家系中患者均存在CRYBB1基因c.682 T＞C突变,而家系中表型正常者CRYBB1基因的c.682位点基因型为T/T野生型.产前诊断结果显示胎儿（Ⅳ1）CRYBB1基因c.682位点基因型为T/T野生型.结论 NGS可用于先天性白内障基因突变的快速检测,该家系致病性基因为CRYBB1基因c.682T＞C突变,应用NGS技术结合一代测序技术成功对先证者进行了产前诊断.

关键词：先天性白内障家系谱基因突变 DNA测序分析方法第二代测序产前诊断

一个发作性运动诱发性肌张力障碍家系的PRRT2基因突变研究

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中华医学遗传学杂志 2016年第1期33卷 61-63页

作者：张卉时伟丽肖海吴东秦利涛廖世秀河南省人民医院郑州大学人民医院河南省临床基因诊断与治疗院士工作站郑州450003

目的确定一个中国汉族发作性运动诱发性肌张力障碍（paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD）家系中富脯氨酸跨膜蛋白2（proline—richtransmembrane protein，PRRT2）基因的突变情况。方法收集该家系患者及正常者的外周血，PCR扩增PR... 详细信息

目的确定一个中国汉族发作性运动诱发性肌张力障碍（paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD）家系中富脯氨酸跨膜蛋白2（proline—richtransmembrane protein，PRRT2）基因的突变情况。方法收集该家系患者及正常者的外周血，PCR扩增PRRT2基因的外显子及外显子与内含子连接区，PCR产物直接正反向测序并与数据库进行比对，确定有无PRRT2基因突变以及突变的位点。结果在该家系患者中均检测出了PRR222基因C．649dupC的移码突变。该突变可导致终止密码子的提前形成，使PRRT2蛋白发生截短，经查阅人类基因突变数据库证实该突变与PKD相关。家系中表型正常人未检测到该突变。结论PRRT2基因c．649dupC移码突变可能是该发作性运动诱发性肌张力障碍家系的致病原因，通过基因诊断和产前诊断可以有效阻止致病基因的侍谱。降低生育患儿的风险。

关键词：发作性运动诱发性肌张力障碍 PRRT2基因基因突变基因检测

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一个Wiskott-Aldrich综合征家系融S基因的突变分析

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中华医学遗传学杂志 2018年第2期35卷 207-209页

作者：时伟丽侯巧芳张卉娄桂予张玉薇廖世秀河南省人民医院(郑州大学人民医院)河南省医学遗传研究所郑州450003

目的探讨1个汉族Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrich syndrome）家系WAS基因的突变情况。方法PCR扩增WAS基因的外显子及外显子与内含子的连接区域，对PCR产物直接进行正、反向测序并与数据库进行比对，确定有无WAS基因突变以及突... 详细信息

目的探讨1个汉族Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrich syndrome）家系WAS基因的突变情况。方法PCR扩增WAS基因的外显子及外显子与内含子的连接区域，对PCR产物直接进行正、反向测序并与数据库进行比对，确定有无WAS基因突变以及突变的位点。测定家系成员B细胞活化因子（B-cell activating factor, BAFF）的水平。结果家系中2例患者均携带WAS基因第2外显子c.257G〉A的半合子突变，先证者的母亲为c.257G〉A的杂合突变携带者，其他表型正常家系成员均未检测到该突变，经查阅人类基因突变数据库证实该突变为已知致病突变。家系中患者血清BAFF水平明显高于表型正常的成员。结论WAS基因c.257G〉A的突变可能是该Wiskott-Aldrich综合征家系的致病原因。

关键词： Wiskott-Aldrich综合征 WAS基因基因突变基因检测

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一例9q34.3微缺失综合征患儿的临床及遗传学分析

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中华医学遗传学杂志 2017年第6期34卷 849-852页

作者：吴东李涛王红丹时伟丽侯巧芳张卉王涛杨艳丽廖世秀河南省人民医院河南省医学遗传研究所郑州大学人民医院郑州450003

目的明确1例智力低下、发育迟缓的患儿染色体拷贝数变异的性质及来源，分析其与表型的相关性。方法采用常规G显带分析患儿及其父母的外周血染色体核型，并用微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，aCGH）技... 详细信息

目的明确1例智力低下、发育迟缓的患儿染色体拷贝数变异的性质及来源，分析其与表型的相关性。方法采用常规G显带分析患儿及其父母的外周血染色体核型，并用微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，aCGH）技术进行检测。结果患儿及其父母核型未见异常，aCGH检测结果显示患儿染色体9q34．3区存在405kb的杂合缺失，该区域包含EHMT1基因和部分CACNAlB基因，其父母则未携带染色体微重复／微缺失。结论患儿染色体9q34．3区的杂合缺失为新发突变，可能是患儿患病的原因。EHMTl可能是9q34．3微缺失综合征关键基因之一。

关键词： 9q34.3微缺失综合征智力低下发育迟缓比较基因组芯片杂交

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美国临床基因检测后遗传咨询的原则与实践

中华医学遗传学杂志 2019年第1期36卷 92-98页

作者：陈锦云向碧霞孙骅时伟丽赵怡如沈珺祁鸣麻省总医院神经系美国波士顿MA02114 开罗诊断公司临床细胞遗传学部美国普利山维尔NY10570 波士顿儿童医院肾脏系美国波士顿MA02115 河南省人民医院郑州大学人民医院河南省医学遗传研究所郑州450003 哈佛医学院布莱根和妇女医院病理系美国波士顿MA02115 浙江大学医学院人类遗传学系、附属第一医院遗传与基因组医学中心、附属邵逸夫医院生殖中心、杭州迪安诊断杭州310058 罗切斯特大学医学中心病理与临床检验系美国罗切斯特NY14627

临床基因检测后的结果需告知受检方。为确保受检方能够正确领悟检测结果的意义,检测后的遗传咨询必不可少。咨询的方式、对象、执行者和内容因受检者的情况、检测的项目以及结果而异,但遗传咨询的伦理原则和实践宗旨不变。在美国,遗传... 详细信息

临床基因检测后的结果需告知受检方。为确保受检方能够正确领悟检测结果的意义,检测后的遗传咨询必不可少。咨询的方式、对象、执行者和内容因受检者的情况、检测的项目以及结果而异,但遗传咨询的伦理原则和实践宗旨不变。在美国,遗传咨询行业已经成熟。本文将介绍美国临床基因检测后遗传咨询的宗旨并详细解析其在各种情况下的应用,以期为中国遗传咨询行业的规范化发展提供启示。

关键词：遗传咨询基因检测检测后咨询心理社会影响

生殖细胞特异表达蛋白SP3111在受精及早期胚胎发育中的作用

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中华男科学杂志 2010年第1期16卷 14-19页

作者：贾晓峰周密林菊芳时伟丽张晓东施惠娟国家人口和计划生育委员会计划生育药具重点实验室上海计划生育科学研究所上海200032 复旦大学脑科学研究院上海200032 华东理工大学生物工程学院上海200237 复旦大学医学院上海200032

目的:采用抗SP3111抗体Ab2438封闭后的体外受精试验,研究SP3111蛋白在受精及早期胚胎发育过程中的作用。方法:首先在体外受精前,将精子分为3组:实验组、空白对照组、阴性对照组。实验组精子与Ab2438共同孵育1h后进行体外受精,观察2、4、... 详细信息

目的:采用抗SP3111抗体Ab2438封闭后的体外受精试验,研究SP3111蛋白在受精及早期胚胎发育过程中的作用。方法:首先在体外受精前,将精子分为3组:实验组、空白对照组、阴性对照组。实验组精子与Ab2438共同孵育1h后进行体外受精,观察2、4、6、8、22h的受精率及碎裂胚胎的发生率。接着将Ab2438作用于受精后的卵母细胞,观察作用22h后的受精率及碎裂胚胎的发生率。结果:抗体Ab2438作用小鼠精子后,碎裂胚胎发生率在加入精子后2、4、6、8、22h分别为5.26%、8.77%、23.25%、43.42%、59.21%,与各对照组碎裂胚胎形成率均有显著性差异(P<0.01)。Ab2438作用于受精后的卵母细胞,22h后实验组的正常胚胎及碎裂胚胎的形成率分别为23.64%和63.64%,与各对照组相比差异有显著性(P<0.01)。结论:抗SP3111抗体对小鼠受精及早期胚胎发育有明显的影响,因此SP3111蛋白可能是一个信号分子,与其他蛋白一起在受精和早期胚胎发育中发挥作用,对SP3111蛋白生殖功能的进一步研究将为不育的分子机制的研究提供新的思路。

关键词：精子抗体 SP3111 体外受精早期胚胎发育抗体封闭

人类微小RNA-409-3p靶基因预测及生物信息学分析

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中国优生与遗传杂志 2017年第11期25卷 18-19,66页

作者：时伟丽王鑫廖世秀河南省人民医院郑州大学人民医院河南省医学遗传研究所河南郑州450003

目的采用生物信息学技术预测人类微小RNA-409-3p(hsa-miR-409-3p)靶基因,并分析其可能参与的生物学过程及信号通路。方法应用miRbase数据库和UCSC Genome Browser分析工具获取hsa-miR-409-3p的染色体定位、碱基序列和物种保守性等基本信... 详细信息

目的采用生物信息学技术预测人类微小RNA-409-3p(hsa-miR-409-3p)靶基因,并分析其可能参与的生物学过程及信号通路。方法应用miRbase数据库和UCSC Genome Browser分析工具获取hsa-miR-409-3p的染色体定位、碱基序列和物种保守性等基本信息,利用miRanda、miRDB、Target Scan和miRwalk进行靶基因预测,采用miRwalk网站对靶基因取交集,合并有文献支持和经实验证实的靶基因作为基因集,对基因集进行功能富集分析(GO分析)和信号通路分析。结果hsa-miR-409-3p序列在各物种间高度保守。对miRanda、miRDB、Target Scan和miRwalk预测的靶基因进行交集后共得到273个靶基因。miRwalk中检索到经验证的靶基因有133个。合并后进行GO分析,结果显示靶基因富集于细胞粘附、细胞基质粘附、生长调节、调节干细胞群维持、学习或记忆、突触传递的负调节等(P<0.05)。信号通路分析结果显示靶基因富集于PI3K-Akt信号通路、Hippo信号通路、AMPK信号通路、神经营养蛋白信号通路、B细胞受体信号通路、安非他明成瘾等(P<0.05)。结论 hsa-miR-409-3p参与神经系统功能及其调节的生物学过程,与神经系统疾病的发生密切相关。

关键词：微小RNA-409-3p 生物信息学靶基因

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一例6q27微缺失的产前诊断及遗传学分析

中华医学遗传学杂志 2017年第5期34卷 718-721页

作者：吴东时伟丽王红丹侯巧芳张卉李涛张朝阳杨艳丽廖世秀河南省人民医院、河南省医学遗传研究所、郑州大学人民医院郑州450003

目的明确1例侧脑室增宽胎儿染色体拷贝数变异的性质及来源，分析其预后及发生机制。方法常规G显带分析胎儿羊水细胞及其父母的外周血染色体核型，应用微阵列比较基因组杂交（arraycomparative genomic hybridization，aCGH）技术对胎儿... 详细信息

目的明确1例侧脑室增宽胎儿染色体拷贝数变异的性质及来源，分析其预后及发生机制。方法常规G显带分析胎儿羊水细胞及其父母的外周血染色体核型，应用微阵列比较基因组杂交（arraycomparative genomic hybridization，aCGH）技术对胎儿及其父母进行检测。结果G显带分析胎儿及其父母染色体核型未见异常。aCGH检测显示胎儿染色体6q27区存在2．04Mb杂合性缺失，其父母未检测到染色体微重复／微缺失。6q27区包含多个与脑部发育相关的基因。染色体断裂点附近包含2410bp的回文序列，能够形成稳定的二级结构。结论胎儿携带染色体6q27区的微缺失，属于新发突变，具有致病性，与脑部结构的发育异常相关。染色体断裂点附近的回文序列可能参与了上述微缺失的形成。

关键词： 6q27微缺失产前诊断微阵列比较基因组杂交