检索结果-南通市图书馆

作者：施长华东华大学

学位级别：硕士

研究证实蛛丝是由蛋白质组成,具有弹性大、强度高、延展性好等特点,使得其成为研究蛋白质结构与功能的热点;同时蛛丝也是理想的生物材料,具有广阔的应用前景。由于生活习性不同,蜘蛛不能像家蚕一样高密度人工饲养,因此应用基因工程方法... 详细信息

研究证实蛛丝是由蛋白质组成,具有弹性大、强度高、延展性好等特点,使得其成为研究蛋白质结构与功能的热点;同时蛛丝也是理想的生物材料,具有广阔的应用前景。由于生活习性不同,蜘蛛不能像家蚕一样高密度人工饲养,因此应用基因工程方法来获取蛛丝蛋白成为了生物学家们一直孜孜不倦的奋斗目标。蛛丝蛋白的长度及高重复氨基酸模块使得利用常规的基因工程方法无法获得蛛丝蛋白。蛋白质内含子(intein)是上世纪90年代发现的,它的发现给蛋白质工程带来了新的研究方法和思路。蛋白质内含子是位于蛋白质前体中的插入序列,其两侧的氨基酸序列称为蛋白质外显子。在蛋白质前体翻译后成熟过程中,蛋白质内含子通过四步亲核置换反应,精确地从蛋白前体中自我切除,同时催化两侧蛋白质外显子以天然肽键相连产生成熟蛋白,这一过程称为蛋白质剪接。将标准蛋白质内含子的N端和C端剪接活性区域以及两端的蛋白质外显子分在两个开放阅读框架中表达,即构成了断裂蛋白质内含子。断裂蛋白质内含子通过两端剪接活性区域相互识别重新构成活性中心,然后再按标准蛋白质内含子的四步亲核置换反应完成两端外显子的连接,这一过程称之为反式剪接。蛋白质内为蛋白质合成和加工提供了新的途径,断裂蛋白质内含子的发现更是使得这项技术的应用价值提升到一个新的高度。本课题研究的主要方法是采用高剪接活性的断裂蛋白质内含子作为工具,拼接大分子量的且具有高度重复氨基酸模块的蛛丝蛋白,为解决这一难题提供了新的研究思路。将实验室前期通过基因文库筛选得到的一段-700bp大腹园蛛基因序列,序列分析表明：这段基因处于大腹园蛛鞭毛状丝基因的重复框架中,且包含了完整的重复单元。根据大肠杆菌密码子偏爱性,对这段基因进行密码子优化,然后依照鞭毛状丝特点将这段序列进行7次重复,并在重复片段的两端加上人工合成的蛛丝基因的N端和C端非重复序列,构造一个类全长的蛛丝基因(N-Sc7-C)。最终将这段类全长基因分成三段(N-Sc2,Sc3,Sc2-C)分别与两个断裂蛋白质内含子(SG,RB)融合构建成三个载体(pE-N-Sc2-SG, pE-SG-Sc3-RB,pE-RB-Sc2-C),并在大肠杆菌中进行诱导表达。对诱导后的蛋白分别进行纯化,并进行体外拼接蛛丝蛋白。优化后的蛛丝基因与蛋白质内含子的融合蛋白在大肠杆菌体内成功的诱导表达,产量达到45 mg/L,纯度达到80%以上。纯化后的蛋白通过断裂蛋白质内含子介导的反式剪接进行蛛丝蛋白的体外拼接。蛋白质内含子发生一次剪接的效率达到了60-80%,最终类全长的蛛丝蛋白(二次剪接产物)的产量可以达到总蛋白的20%。通过这种方法,我们首次在体外成功的拼接出类全长的蛛丝蛋白,且蛋白的大小达150 kD。本研究课题选择大肠杆菌表达系统有着显著的优势,为日后进行大规模的工业化生产提供便利,同时利用蛋白质内含子剪接蛛丝蛋白这一平台为表达其他大分子量、多结构域的复杂蛋白提供了一种新的途径。

关键词：蜘蛛鞭毛状丝蛋白质内含子反式剪接表达

利用小肽控制的基于蛋白质内含子非层析标签制备重组蛋白(英文)

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中国生物化学与分子生物学报 2014年第2期30卷 202-208页

作者：施长华孟清 Wood D W 东华大学生物科学与技术研究所上海201620 Department of Chemical and Biomolecular Engineering OhioState University

基于蛋白质内含子的蛋白质纯化自我断裂标签已经被广泛使用超过15年之久.但这一系统体内表达过程的提前断裂一直是限制这一技术广泛应用的瓶颈,特别是在需要高温表达和长表达周期的真核表达系统中.本研究介绍了一种利用小肽控制的基于... 详细信息

基于蛋白质内含子的蛋白质纯化自我断裂标签已经被广泛使用超过15年之久.但这一系统体内表达过程的提前断裂一直是限制这一技术广泛应用的瓶颈,特别是在需要高温表达和长表达周期的真核表达系统中.本研究介绍了一种利用小肽控制的基于蛋白质内含子和非层析标签ELP(elastin-like polypeptide)的自我断裂系统.在这一系统中,蛋白质内含子的体内外活性严格受到其结构互补小肽控制.在体内表达不含有互补小肽时,蛋白质内含子不具有活性;而在体外添加结构互补小肽,蛋白质内含子结构恢复并发生C端断裂反应释放目的蛋白.由于非层析标签ELP的引入,因此整个纯化过程可以简单地通过几步机械沉淀完成.此外,这一系统反应pH、小肽与前体蛋白之间的摩尔比及断裂速率也一并进行了系统的研究.

关键词：小肽蛋白质内含子非层析标签生物分离蛋白质纯化标签纯化

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浅谈微型挖掘机

农业开发与装备 2015年第8期 75-76页

作者：施长华常州汉森机械有限公司江苏常州213033

微型挖掘机是一种应用于各种狭窄空间的施工作业以及农业辅助作业的重要设备;中大型挖掘机,由于体积庞大,需要的空间位置较广,灵活性差,且价格较贵,因此慢慢地不被一些用户所接收;随着土地改革,农业机械化的发展,微型挖掘机渐渐地进入... 详细信息

微型挖掘机是一种应用于各种狭窄空间的施工作业以及农业辅助作业的重要设备;中大型挖掘机,由于体积庞大,需要的空间位置较广,灵活性差,且价格较贵,因此慢慢地不被一些用户所接收;随着土地改革,农业机械化的发展,微型挖掘机渐渐地进入了农业领域从而取代人工作业。

关键词：微型挖掘机市场前景分析

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HSW06微型挖掘机总体设计

农业开发与装备 2015年第7期 67-68页

作者：施长华常州汉森机械有限公司江苏常州213033

微型挖掘机是农业、工程作业生产的重要环节,本项目研制的微型挖掘机是目前国内市场上较小的挖掘机,区别于国内小型挖掘机,其体积更小,机动灵活,适用于各种狭窄空间的施工作业以及家用辅助作业,并且能够安装许多辅助作业工具,实现一机... 详细信息

微型挖掘机是农业、工程作业生产的重要环节,本项目研制的微型挖掘机是目前国内市场上较小的挖掘机,区别于国内小型挖掘机,其体积更小,机动灵活,适用于各种狭窄空间的施工作业以及家用辅助作业,并且能够安装许多辅助作业工具,实现一机多用的功能;详细介绍了HSW06型挖掘机结构、技术参数,分析了该型挖机动力传动系统和电气系统。对影响设备主要性能参数的各单元进行分析计算,并在最后对影响施工安全性能进行了论述。

关键词：微型挖掘机总体设计分析计算

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谈谈《最后一课》的爱国情韵

语文教学之友 2011年第7期30卷 25-26页

作者：施长华东台市三仓镇中学

法国19世纪现实主义作家都德的《最后一课》是中学语文教材中的传统篇目，作为文学史上脍炙人口的名篇，曾博得不同时代、不同国家读者的喜爱。从某种程度上说，这得力于小说中所蕴含着的深厚的爱国情韵。

关键词：《最后一课》情韵爱国中学语文教材现实主义作家 19世纪文学史都德

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鲁迅先生的“豆”缘

中华活页文选（教师） 2012年第3期 74-76页

作者：施长华江苏省东台市三仓镇中学

初中语文课本选录了鲁迅先生的短篇小说《孔乙己》《故乡》和《社戏》，这三篇皆出自小说集《呐喊》，它们有一个共同特点，即都提到了同一类粮食作物-豆：《孔乙己》中有茴香豆，《故乡》中有干青豆，《社戏》中有罗汉豆。偶然中存在... 详细信息

初中语文课本选录了鲁迅先生的短篇小说《孔乙己》《故乡》和《社戏》，这三篇皆出自小说集《呐喊》，它们有一个共同特点，即都提到了同一类粮食作物-豆：《孔乙己》中有茴香豆，《故乡》中有干青豆，《社戏》中有罗汉豆。偶然中存在着必然，鲁迅先生的这三篇小说分别作于1918年冬至1922年10月之间，时值五四新文学革命的高潮期，三部作品中豆的不同状态的交替变化，与作者人生观的形成与发展有着密切的联系。

关键词：鲁迅《孔乙己》《社戏》《故乡》短篇小说新文学革命语文课本《呐喊》

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浅谈《在烈日和暴雨下》中的“坐车人”

语文教学之友 2011年第2期30卷 28-29页

作者：施长华东台市三仓镇中学

《在烈日和暴雨下》不仅刻画了祥子,而且还描写了另一个人物——坐车人。准确把握作品对坐车人的刻画有助于我们更深刻地理解小说的主旨。本文试就坐车人的形象、作者刻画坐车人的意图及方法略作分析。

关键词：《在烈日和暴雨下》人的形象祥子描写地理

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蛛丝蛋白基因在大肠杆菌中表达研究

生物学杂志 2011年第1期28卷 6-9页

作者：施长华孟清东华大学生物科学与技术研究所上海201620

利用大腹园蛛基因组文库筛选获得一段693 bp基因片段,经分析该段基因处于鞭毛状丝基因重复区域,且其中包含了一个完整的重复框架。通过基因密码子优化,在其3′和5′端分别融合蛋白质亲和层析标签,克隆于pET30LIC表达载体中,在不同的大... 详细信息

利用大腹园蛛基因组文库筛选获得一段693 bp基因片段,经分析该段基因处于鞭毛状丝基因重复区域,且其中包含了一个完整的重复框架。通过基因密码子优化,在其3′和5′端分别融合蛋白质亲和层析标签,克隆于pET30LIC表达载体中,在不同的大肠杆菌中进行表达试验。实验结果显示：经过密码子优化,融合目的蛋白基因在BL21（DE3）中得到了高效表达,产量达到25-30mg/L,纯化产物纯度达90%以上。SDS-PAGE和W estern-b lotting检测目的融合蛋白均与预期蛋白大小一致。

关键词：蜘蛛鞭毛状丝重组蛋白基因表达密码子优化

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来自金华市公众科学素养的调查报告

科协论坛 2008年第2期23卷 19-21页

作者：盛有军施长华沈希进浙江省金华市科协

公众科学素养是城市竞争力的重要基础，其总体水平决定着一个地区综合实力的高低，影响着一个地区经济和社会的全面协调持续发展。为了全面、客观、真实地反映和分析浙江省金华市公众科学素养状况，为政府决策服务，经市统计局批准，200... 详细信息

公众科学素养是城市竞争力的重要基础，其总体水平决定着一个地区综合实力的高低，影响着一个地区经济和社会的全面协调持续发展。为了全面、客观、真实地反映和分析浙江省金华市公众科学素养状况，为政府决策服务，经市统计局批准，2007年市科协参照国内外通用做法，开展了本市首次公众科学素养调查。

关键词：公众科学素养金华市地区综合实力城市竞争力持续发展地区经济决策服务浙江省