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骨胶原凝胶制备及与细胞—微球复合构建组织工程骨的研究

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骨胶原凝胶制备及与细胞—微球复合构建组织工程骨的研究

作者：施洪臣第三军医大学

学位级别：硕士

目的:观察大孔明胶可降解微球(Cutispher G)在微重力旋转培养条件下扩增人骨髓间充质干细胞对细胞增殖及特性的影响;检测增强酶解法提取的猪皮质骨胶原的生物相容性,制备其凝胶液并与细胞-微球复合构建工程组织,成骨诱导培养后观察该工... 详细信息

目的:观察大孔明胶可降解微球(Cutispher G)在微重力旋转培养条件下扩增人骨髓间充质干细胞对细胞增殖及特性的影响;检测增强酶解法提取的猪皮质骨胶原的生物相容性,制备其凝胶液并与细胞-微球复合构建工程组织,成骨诱导培养后观察该工程组织的成骨效果。方法:1、采用自建的“增强酶解技术”从猪骨中提取骨胶原,制备凝胶液并冻干为胶原膜,与hMSCs共培养,观察细胞在骨胶原膜中的生长情况;植入兔体内,观察组织相容性及体内降解情况;利用胶原涂层β-TCP支架,观察其对细胞上架及上架细胞的影响。2、体外分离hMSCs,扩增至第2代后分为两组。实验组收集1×10个细胞与预处理后的0.25g CultiSpher G均匀混合后加入容积为50ml的高截面纵横比容器内,加入培养基及血清,在旋转细胞培养系统上进行体外动态培养。对照组则按检测需要的比例,继续静止培养。不同时相点取材行甲基紫、MTT染色或固定后切片HE染色,观察细胞在微球的分布情况;于培养后1、2、3周取样,行扫描电镜观察;连续2周,每天从两种方法培养的细胞中取样行细胞计数、MTT检测,观察细胞的增殖情况;在培养第5d和第7d分别从两组细胞中取样,行细胞周期和细胞表面标志CD34、CD29检测,判定RCCS培养方式对培养细胞性质有无影响。3、将扩增后的细胞-微球复合物按细胞浓度1×10/ml与冰浴状态下的胶原凝胶液均匀混合,中性、37℃条件下凝胶液固化,完成组织构建,同时制备单纯的细胞-凝胶复合物作为对照,随培养时间延长观察两种组织外观及质地变化。4、利用上述凝胶固化法制备组织工程骨作为实验组,同时以DBM为支架,常规静止接种法构建组织工程骨作为对照组,行成骨诱导培养,倒置显微镜下观察组织中细胞形态、分布情况,并在不同时相点取材,测定DNA含量、碱性磷酸酶活性(ALP),定量评定hMSCs增殖、成骨分化效果。结果:1、胶原膜细胞复合培养,无明显细胞毒性表现,hMSCs增殖迅速,生长无受抑表现;2、兔体内埋植试验,无明显毒性反应,胶原膜1周时即明显降解,2周左右完全吸收;3、胶原作为β-TCP涂层材料使接种效率由46.95%提高到60.60%,且上架的细胞活性恢复迅速,增殖较未处理组快(P＜0.05);4、RCCS培养,接种24h,显微镜下观察大部分细胞贴附于微球表面,随培养时间延长细胞数量增多,并分泌大量基质,将多个微球裹在一起;甲基紫、MTT染色提示微球上细胞随培养时间延长数量逐渐增多,固定后切片HE染色可见大量细胞贴附于微球表面,并有部分细胞长入微球孔隙中;5、MTT检测及细胞计数提示利用RCCS培养hMSCs:对数生长期由静止培养的3d延长到6d,生长高峰时收获细胞总量由静止培养获得接种量的3.17倍增加为10.75倍;6、细胞周期检测两种方法无明显差别,大部细胞处在G1期;表面标志检测两种方法培养的细胞均保持了良好的干细胞特性,CD34阴性表达,CD29阳性表达;7、骨胶原凝胶液在中性、37℃环境中约10min固化,倒置显微镜观察,构建后2h细胞从微球表面突起,24h后在凝胶中伸展,呈三维立体生长;8、大体观察,刚构建的组织块呈半固态胶状,柔软,易裂,表面光滑,随培养时间延长,组织块机械强度逐渐增强,表面开始皱缩,14d时韧如橡胶;构建24h后,复合物体积随细胞增殖开始缩小,14d天后对照组样本直径仅为原来的27.33%,而试验组为85.33%;9、两组复合物内DNA含量、ALP活性随培养时间延长增加显著,且实验组增速快于对照组(P＜0.05)。结论:1、增强酶解法提取的骨胶原具有良好的生物相容性和凝胶固化特性;2、CultiSpher G结合RCCS是体外规模化扩增hMSC的有效方法;3、细胞-微球复合骨胶原凝胶构建的组织,成骨诱导培养后具有一定的力学强度和成骨活性;4、细胞-微球复合骨胶原凝胶固化构建组织工程骨的方法具有避免消化收集种子细胞,接种效率高,操作简单等优点,是一条较为理想的组织工程骨构建技术路线。

关键词：组织工程 I型骨胶原旋转培养组织构建

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预防椎板切除术后硬脊膜周围粘连的研究进展

中国矫形外科杂志 2006年第6期14卷 452-456页

作者：施洪臣周强解放军第285医院手外科河北邯郸056002 第三军医大学西南医院骨科重庆市400038

'椎板切除'是手术治疗腰椎间盘突出、椎管狭窄等脊柱疾患中的常规步骤,但部分病例椎板切除部在术后愈合过程中所形成瘢痕组织可突入椎管,造成医源性椎管狭窄.

关键词：椎板切除术后瘢痕粘连下腰部手术失败综合征医源性椎管狭窄周围预防硬脊膜 syndrome surgery 腰椎间盘突出

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低旋转点外踝上皮瓣修复前足软组织缺损

中国修复重建外科杂志 2012年第6期26卷 761-763页

作者：施洪臣章雪松李宝山徐格周强解放军第285医院手足外科北京军区手外科研究诊疗中心河北邯郸056001 第三军医大学西南医院骨科

目的总结采用低旋转点外踝上皮瓣修复前足皮肤软组织缺损的疗效。方法 2003年10月-2011年3月,收治16例前足皮肤软组织缺损。男12例,女4例;年龄6～48岁,平均22.3岁。外伤12例,烧伤3例,冻伤1例。皮肤软组织缺损范围为5 cm×4 cm～11 cm×6... 详细信息

目的总结采用低旋转点外踝上皮瓣修复前足皮肤软组织缺损的疗效。方法 2003年10月-2011年3月,收治16例前足皮肤软组织缺损。男12例,女4例;年龄6～48岁,平均22.3岁。外伤12例,烧伤3例,冻伤1例。皮肤软组织缺损范围为5 cm×4 cm～11 cm×6 cm。以外踝上0～3 cm处为轴点切取外踝上皮瓣修复创面,皮瓣切取范围6 cm×5 cm～12 cm×8 cm。供区游离植皮修复。结果术后3 d 2例发生皮瓣坏死,经对症处理后愈合;其余皮瓣及供区植皮均顺利成活,创面Ⅰ期愈合。患者均获随访,随访时间6个月～2年,平均16个月。皮瓣外形略臃肿,色泽与受区正常皮肤相似,质地良好。术后3个月皮瓣两点辨别觉为4～6 mm。结论低旋转点外踝上皮瓣覆盖范围广,不牺牲主要动脉,是修复前足皮肤软组织缺损的较好方法之一。

关键词：低旋转点外踝上皮瓣前足软组织缺损创面修复

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两法提取皮质骨Ⅰ型胶原的比较研究

中国矫形外科杂志 2007年第6期15卷 463-466页

作者：施洪臣吕仁发周强许建中第三军医大学西南医院骨科重庆市400038

[目的]通过对两种方法提取的骨胶原产量及特性的比较,推荐一种较为理想的提取皮质骨I型胶原的方法。[方法]以猪皮质骨为原料,去除软组织后劈成小骨块,经酒精梯度脱水、无水乙醚脱脂、盐酸脱钙、甲醇:氯仿(1:1,v/v)再脱脂处理后,骨块软... 详细信息

[目的]通过对两种方法提取的骨胶原产量及特性的比较,推荐一种较为理想的提取皮质骨I型胶原的方法。[方法]以猪皮质骨为原料,去除软组织后劈成小骨块,经酒精梯度脱水、无水乙醚脱脂、盐酸脱钙、甲醇:氯仿(1:1,v/v)再脱脂处理后,骨块软化。然后将软化的骨块在高速粉碎机上粉碎成脱钙骨基质粉。分别采用传统的碱溶法和自建的增强酶解法对脱钙骨基质粉处理,经溶解、离心、透析、冻干等操作提取皮质骨胶原。最后对增强酶解法所得产物进行鉴定,并对两种提取方法的效率及得到的产物的外观、黏度、凝胶固化性进行比较。[结果]增强酶解法所得胶原的氨基酸组成、蛋白电泳、相对分子量大小、最大光吸收波长均符合I型胶原特征;和碱溶法比较,提取率由(57.8±4.96)%提高到(94.04±0.55)%;其相同浓度(0.03%,w/v)醋酸溶液黏度测定,增强酶解法为3.71,碱提法为2.81;在37.0℃,pH值7.35～7.45条件下行凝胶固化性检测,增强酶解法所提胶原凝胶液约10min可固化形成凝胶块,而碱提法所提胶原的溶液仍为黏性液体。[结论]增强酶解法提取的骨胶原是I型胶原;相对于碱提法,该法提取效率高,所得胶原纯度高、黏性好、固化性好,是一种较好的从猪皮质骨中制备I型胶原的方法。

关键词：皮质骨Ⅰ型胶原增强酶解法碱溶法

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多孔明胶微载体旋转培养hMSC的研究

中国矫形外科杂志 2012年第13期20卷 1230-1234页

作者：施洪臣周强罗飞解放军第285医院手足外科河北邯郸056001 第三军医大学西南医院骨科重庆400038

[目的]观察利用多孔微载体结合旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)培养人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cell,hMSC)对其增殖的影响。[方法]体外分离hMSC,扩增至第2代(P2)后分为两组。实验组采用多孔明胶微载... 详细信息

[目的]观察利用多孔微载体结合旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)培养人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cell,hMSC)对其增殖的影响。[方法]体外分离hMSC,扩增至第2代(P2)后分为两组。实验组采用多孔明胶微载体CultiSpher G在RCCS内进行动态培养,对照组则继续静止培养。应用倒置显微镜、扫描电镜对微载体表面的细胞粘附、生长情况进行观察,并在不同的时相点取样,行细胞计数、MTT检测,了解细胞的增殖情况。[结果]接种24 h后,大部分细胞贴附于微载体表面,随培养时间延长细胞数量增多并分泌大量基质。MTT检测及细胞计数提示细胞对数生长期较静止培养方法延长,达到生长高峰时旋转培养方法收获细胞总量为接种时10.75倍,而静止培养方法为3.19倍;细胞周期检测两种方法差别不大,大部细胞均处在S1期。[结论]Culti Spher G微载体旋转培养系统是体外扩增hMSC的有效方法,利用该系统可为工程化组织的构建提供大量特性稳定的种子细胞。

关键词： Culti Spher G多孔微载体旋转细胞培养系统细胞培养

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做好医师到基层部队代职工作的思考

人民军医 2012年第8期55卷 782-783页

作者：施洪臣付松林张华解放军285医院手外科河北邯郸056001 解放军285医院医务处河北邯郸056001

根据上级规定,医院每年都要安排医师到基层部队医疗机构代职,并已成为一项常态性工作。但如何避免代职流于形式,既能真正发挥代职医师的作用和使他们得到锻炼,又能促进基层医疗机构建设和卫生人员技术的提高,是目前需要认真研究和探讨... 详细信息

根据上级规定,医院每年都要安排医师到基层部队医疗机构代职,并已成为一项常态性工作。但如何避免代职流于形式,既能真正发挥代职医师的作用和使他们得到锻炼,又能促进基层医疗机构建设和卫生人员技术的提高,是目前需要认真研究和探讨的问题。

关键词：医师基层部队代职

等离子体氟改性TiO_(2)催化剂的制备及其光催化性能

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材料研究学报 2024年第2期38卷 141-150页

作者：周立臣中海石油(中国)有限公司湛江分公司湛江524000

以C_(2)H_(2)F_(4)为F源,用等离子体放电对TiO_(2)实现F改性制备TiO_(2)催化剂,并使用XRD、XPS、UV-vis、PL等手段表征其形貌和结构。以亚甲基蓝和油田废水作为污染物,研究外部环境对催化剂降解性能的影响和重复使用性能,并使用自由基... 详细信息

以C_(2)H_(2)F_(4)为F源,用等离子体放电对TiO_(2)实现F改性制备TiO_(2)催化剂,并使用XRD、XPS、UV-vis、PL等手段表征其形貌和结构。以亚甲基蓝和油田废水作为污染物,研究外部环境对催化剂降解性能的影响和重复使用性能,并使用自由基清除剂揭示其光催化机理。结果表明,催化剂添加量为8 g/L、pH值为6时,其对油田废水的降解效果最佳化学需氧量(COD)的去除率可达88%。同时,环境中的HCO_(3)^(-)、CO_(3)^(2-)、PO_(4)^(3-)、SiO_(3)2-能显著抑制光催化反应,而Cl^(-)的影响不大。羟基自由基(·OH)对光催化反应的影响更为关键。等离子体氟改性后,二氧化钛表面产生大量的≡Ti-F键和氧缺陷,实现了TiO_(2)的间隙F掺杂(Ti-O-F-Ti键),≡Ti-F和氧缺陷促进了光生电子-空穴向TiO_(2)表面转移。同时,间隙F掺杂在TiO_(2)价带上方产生杂质能级,使禁带宽度从2.98 eV收窄到2.82 eV,增强了这种催化剂在可见光区域的吸收,提高了其对油田废水的光催化降解效率。

关键词：无机非金属材料工业催化油田废水等离子体 TiO_(2)光催化

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内部审计关键考核指标量化管理浅析

活力 2024年第16期 133-135页

作者：施增洪海亮集团有限公司杭州310000

内部审计作为企业运营管理中的一个环节,主要目的是促进企业合法合规经营,防范企业经营风险及实现提质增效。审计是一项管理工作,管理工作见成效没那么直接和明显,尤其是不同的人对审计成果价值大小的认知可能会有很大差异,所以在审计... 详细信息

内部审计作为企业运营管理中的一个环节,主要目的是促进企业合法合规经营,防范企业经营风险及实现提质增效。审计是一项管理工作,管理工作见成效没那么直接和明显,尤其是不同的人对审计成果价值大小的认知可能会有很大差异,所以在审计部门的日常管理中,经常会遇到一些问题。为了规避问题,提高管理活动可行性,文章对相关工作进行研究。

关键词：内部审计关键考核指标

财务柔性是否会影响商业银行系统性风险?——基于信贷过度扩张与表外业务渠道

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系统工程理论与实践 2024年第5期44卷 1468-1484页

作者：顾海峰曹玉臣东华大学旭日工商管理学院上海200051

建立及完善商业银行财务柔性维度的监管机制,对于防控银行业系统性风险具有重要意义.文章选取2010–2021年中国上市银行季度数据,构建面板回归模型对财务柔性对银行系统性风险的影响及其作用机制进行了实证分析.研究表明:1)财务柔性对... 详细信息

建立及完善商业银行财务柔性维度的监管机制,对于防控银行业系统性风险具有重要意义.文章选取2010–2021年中国上市银行季度数据,构建面板回归模型对财务柔性对银行系统性风险的影响及其作用机制进行了实证分析.研究表明:1)财务柔性对银行系统性风险具有促进作用.相对于国有银行部门和经济下行期,财务柔性对银行系统性风险的促进作用仅存在于非国有银行部门和经济上行期.2)信贷过度扩张和表外业务在财务柔性与银行系统性风险的关系中承担着多重中介作用,财务柔性主要通过加剧信贷过度扩张与提高表外业务渠道来促进银行系统性风险,“财务柔性-信贷过度扩张/表外业务-银行系统性风险”的传导渠道均有效.3)资管新规与货币政策不确定性对两者关系具有非对称性调节作用.资管新规的实施会减弱财务柔性对银行系统性风险的促进作用,而货币政策不确定性提高则会加剧财务柔性对银行系统性风险的促进作用.4)区分财务柔性类型的进一步研究表明,现金柔性和债务柔性均对银行系统性风险具有促进作用.该成果将为提升银行财务柔性监管效率及防控中国银行业系统性风险提供重要的理论指导与决策参考.

关键词：财务柔性银行系统性风险信贷过度扩张表外业务

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