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乙型脑炎减毒活疫苗株全长感染性克隆的构建及表达外源基因的初步研究

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病毒学报 2014年第6期30卷 652-660页

作者：胡兵杨爽方志正湖北省疾病预防控制中心传染病防治研究所武汉430079 武汉生物制品研究所有限责任公司武汉430060

通过构建乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2的全长cDNA克隆,来初步探讨将其作为表达载体的可行性,为下一步利用乙型脑炎病毒作为载体构建嵌合病毒打下基础。利用长片段RT-PCR的方法分两段扩增出乙型脑炎病毒cDNA,通过片段两端的酶切位点,将c... 详细信息

通过构建乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2的全长cDNA克隆,来初步探讨将其作为表达载体的可行性,为下一步利用乙型脑炎病毒作为载体构建嵌合病毒打下基础。利用长片段RT-PCR的方法分两段扩增出乙型脑炎病毒cDNA,通过片段两端的酶切位点,将cDNA依次连接到pACYC184载体。进一步利用分子克隆的手段,在乙型脑炎病毒基因组cDNA的3′非编码区插入增强型绿色荧光蛋白(Ehanced green fluorescent portein,EGFP)基因作为报告基因,通过体外转录和转染,拯救乙型脑炎病毒和表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎嵌合病毒。采用RT-PCR、蚀斑实验和荧光显微镜观察等方法对恢复病毒进行鉴定。对恢复病毒进行连续6次细胞传代,从病毒生长特性和结构基因稳定性的角度对恢复病毒传代稳定性进行研究。结果表明成功地扩增并构建得到乙型脑炎病毒的全长cDNA,在此基础上进一步构建得到了乙型脑炎嵌合病毒rJEV-EGFP全长cDNA,经过体外转录和转染获得了活的rJEV病毒及嵌合病毒rJEV-EGFP,并采用了多种方法对其进行了鉴定,拯救出的恢复病毒在已传代的代次内稳定性良好,嵌合病毒rJEV-EGFP可稳定地表达绿色荧光蛋白。本研究应用反向遗传学技术构建并在BHK-21细胞中成功地拯救出了rJEV和rJEV-EGFP活病毒,同时也表明乙型脑炎病毒SA14-14-2株可以作为载体来表达外源基因。

关键词：乙型脑炎病毒反向遗传学全长cDNA感染性克隆表达载体增强型绿色荧光蛋白

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乙型肝炎病毒X蛋白和肝细胞癌

中华实验和临床病毒学杂志 1995年第4期9卷 388-392页

作者：方志正黄仕和卫生部武汉生物制品研究所

乙型肝炎病毒Ｘ蛋白和肝细胞癌方志正，黄仕和ＣｌａｕｓＨ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ只有几种病毒与自然宿主的癌症有关，这些病毒分为４个家族：含ＲＮＡ的逆转录病毒，疱疹病毒，乳头瘤病毒和含ＤＮＡ的肝炎病毒。在后３个家族里，肝炎病毒... 详细信息

乙型肝炎病毒Ｘ蛋白和肝细胞癌方志正，黄仕和ＣｌａｕｓＨ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ只有几种病毒与自然宿主的癌症有关，这些病毒分为４个家族：含ＲＮＡ的逆转录病毒，疱疹病毒，乳头瘤病毒和含ＤＮＡ的肝炎病毒。在后３个家族里，肝炎病毒致癌性最强［１］。已经确定了乙型肝...

关键词：乙型肝炎病毒 X蛋白肝细胞癌

复合通用CD4^+Th细胞表位基因的原核表达及免疫学特性

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中国生物制品学杂志 2008年第6期21卷 452-456页

作者：刘汉平方志正武汉生物制品研究所基因工程室武汉430060

目的构建复合通用CD4+Th细胞表位基因的原核表达载体,检测表达蛋白的免疫学特性,并探讨其作为载体蛋白的可能性。方法以限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUC19-Pep10,回收长度为650bp左右的目的片段,插入原核表达载体pQE30... 详细信息

目的构建复合通用CD4+Th细胞表位基因的原核表达载体,检测表达蛋白的免疫学特性,并探讨其作为载体蛋白的可能性。方法以限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUC19-Pep10,回收长度为650bp左右的目的片段,插入原核表达载体pQE30中,获得重组质粒pQE30-Pep10,转化大肠杆菌M15后进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Westernblot分析后,进行亲和层析纯化及透析复性,获得重组蛋白Pep10,将Pep10和TT分别免疫雌性BALB/c小鼠,以间接ELISA法和流式细胞术分别检测其免疫原性和淋巴细胞增殖效应。结果SDS-PAGE显示重组蛋白Pep10相对分子质量约为23000,表达量达41%,主要以包涵体形式表达,Westernblot检测可见特异性染色条带,纯化后纯度达94%,共获得42mg重组蛋白。其体外淋巴细胞增殖效应与TT相当,增殖指数分别为4.216和4.736,而免疫原性远低于TT,特异性IgG几何平均滴度(GMT)分别为1∶15758.65和1∶67558.81。结论已成功构建重组原核表达载体pQE30-Pep10,并在大肠杆菌中高效表达,且表达的重组蛋白Pep10具有良好的淋巴细胞增殖效应和较低的免疫原性,有可能作为一种新型载体蛋白,用于多糖结合疫苗的研制。

关键词： CD4^+Th细胞表位原核表达免疫原性载体蛋白

复合通用CD4^+T辅助细胞表位基因克隆载体的构建及测序

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中国生物制品学杂志 2008年第5期21卷 353-355,359页

作者：刘汉平方志正武汉生物制品研究所基因工程室武汉430060

目的构建复合通用CD4+T辅助细胞表位基因克隆载体,并进行测序。方法由DNA work2.0软件设计并人工合成20条55个碱基的寡核苷酸序列,利用套叠PCR技术人工合成全基因序列,并克隆至pUC19载体,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,酶切鉴定并进行测... 详细信息

目的构建复合通用CD4+T辅助细胞表位基因克隆载体,并进行测序。方法由DNA work2.0软件设计并人工合成20条55个碱基的寡核苷酸序列,利用套叠PCR技术人工合成全基因序列,并克隆至pUC19载体,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,酶切鉴定并进行测序。结果经PCR扩增出645bp的目的DNA片段。酶切鉴定筛选出8个阳性克隆,经测序获得一个序列完全正确的克隆。结论已成功构建了复合通用CD4+T辅助细胞表位基因克隆载体,为研究表位疫苗和细菌多糖结合疫苗提供了新的载体表位。

关键词：通用CD4^+T辅助细胞表位克隆载体构建测序

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应用正交试验研究麻疹疫苗保护剂和冻干条件

中国生物制品学杂志 1997年第2期10卷 104-107页

作者：方志正何建中卫生部武汉生物制品研究所武汉430060

对冻干麻疹活疫苗保护剂、冻干条件等多因素，分三个位级，运用正交实验设计进行试验，并初步筛选出各种保护剂最优成分及冻干过程中温度控制的一般要求。以冻干麻疹活疫苗试验为实例，介绍应用正交试验法在配比配方等多因素情况下的科... 详细信息

对冻干麻疹活疫苗保护剂、冻干条件等多因素，分三个位级，运用正交实验设计进行试验，并初步筛选出各种保护剂最优成分及冻干过程中温度控制的一般要求。以冻干麻疹活疫苗试验为实例，介绍应用正交试验法在配比配方等多因素情况下的科学性和先进性。

关键词：正交试验麻疹活疫苗保护剂冻干条件研制

丙型肝炎病毒基因组及其蛋白结构和功能的研究进展

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中国生物制品学杂志 1993年第3期6卷 139-143页

作者：黄仕和方志正刘中民卫生部武汉生物制品研究所武汉430060

自从1989年,美国Chiron公司的Choo等人首次从HCV慢性感染的黑猩猩血浆中克隆HCV基因组以来,在短短的四年时间内,无论是在HCV基因组的结构和功能的研究上,还是在其编码多聚蛋白的结构和功能的研究上都取得了迅猛的进展。本文综述这两方... 详细信息

自从1989年,美国Chiron公司的Choo等人首次从HCV慢性感染的黑猩猩血浆中克隆HCV基因组以来,在短短的四年时间内,无论是在HCV基因组的结构和功能的研究上,还是在其编码多聚蛋白的结构和功能的研究上都取得了迅猛的进展。本文综述这两方面进展情况。 HCV基因组的结构和功能到目前为止,全世界分离的HCV,共80余株,其中已弄清了8株.HCV基因组完整核苷酸序列:美国株HCV-l和HCV-H;日本株HCV-J、HCV-BK、HC-J4、HC-J6和HC-J8;中国台湾株HCV-T。同时也分析了某些HCV的基因组部分核苷酸序列:美国株HCT8、23、27、Tb、ECl、10、US3、6、11;

关键词：丙型肝炎病毒基因组蛋白

应采用细胞培养法取代动物试验法检定狂犬病疫苗

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中国生物制品学杂志 2003年第3期16卷 192-194页

作者：严家新祝玉桃徐葛林黄仕和方志正武汉生物制品研究所武汉430060

在2000年版中,规定的狂犬病疫苗的多项检定均采用小鼠实验,如病毒滴定、病毒灭活确证试验以及疫苗效力测定等.

关键词：细胞培养法检定狂犬病疫苗实验方法

A群脑膜炎球菌多糖-重组蛋白Pep10结合物的制备及其免疫原性

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中国生物制品学杂志 2008年第7期21卷 591-594页

作者：刘汉平薛红刚方志正武汉生物制品研究所基因工程室武汉430060

目的制备A群脑膜炎球菌多糖(GAMP)-重组蛋白Pep10结合物,并检测其免疫原性,探讨重组蛋白Pep10作为一种候选载体蛋白的可行性。方法GAMP经溴化氰(CNBr)活化后,共价接合己二酰肼(ADH)手臂,在碳二亚胺(EDAC)催化下与重组蛋白Pep10偶联,制... 详细信息

目的制备A群脑膜炎球菌多糖(GAMP)-重组蛋白Pep10结合物,并检测其免疫原性,探讨重组蛋白Pep10作为一种候选载体蛋白的可行性。方法GAMP经溴化氰(CNBr)活化后,共价接合己二酰肼(ADH)手臂,在碳二亚胺(EDAC)催化下与重组蛋白Pep10偶联,制备结合物GAMP-ADH-Pep10。纯化后免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清中抗GAMP IgG抗体水平,并分析载体诱导的免疫抑制率。结果所制备的多糖衍生物GAMP-ADH及多糖-蛋白结合物GAMP-ADH-Pep10均具有GAMP抗原特异活性,免疫小鼠后可诱生比多糖单独免疫更高水平的GAMP血清IgG抗体,且接近GAMP-ADH-TT疫苗诱生的抗体水平,并能形成免疫记忆。重组蛋白Pep10诱导的免疫抑制率远低于TT诱导的免疫抑制率。结论制备的重组蛋白Pep10与A群脑膜炎球菌多糖偶联能发挥较强的载体效应,为研究理想载体蛋白提供了新的思路。

关键词： A群脑膜炎球菌多糖载体蛋白结合物免疫原性

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“刑用重典”与明太祖的角色转换

中国社会科学 2024年第2期 155-171,207,208页

作者：方志远江西师范大学历史文化与旅游学院南昌330027

“刑用重典”是明太祖朱元璋国家治理的重要内容和基本特征,成为明清两代的时代符号和永久记忆。对于“刑用重典”的记忆,随着时间的推移而变化乃至重塑;作为时代符号,“刑用重典”既表现在法外酷刑,也表现在法律本身的严苛,既注入政治... 详细信息

“刑用重典”是明太祖朱元璋国家治理的重要内容和基本特征,成为明清两代的时代符号和永久记忆。对于“刑用重典”的记忆,随着时间的推移而变化乃至重塑;作为时代符号,“刑用重典”既表现在法外酷刑,也表现在法律本身的严苛,既注入政治、经济、文化、外事政策之中,又时时夹带着随意和任性,从而造成严峻冷酷的政治气氛。“刑用重典”经历了一个由打击富民、扶植小农,重视民生、严惩贪吏,到为增加国库收入而剥夺富人及富裕地区、为维护朱氏江山而成批杀功臣及文化人的过程。明太祖本人也发生了由底层民众代表向集权皇朝帝王的角色转换,为民除暴的“本心”则自觉或不自觉地转化为传之万代的“私心”。

关键词：明太祖刑用重典本心私心