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重组人乳铁蛋白分离纯化及其抗宫颈癌细胞活性的研究

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重组人乳铁蛋白分离纯化及其抗宫颈癌细胞活性的研究

作者：支旭勃西北农林科技大学

学位级别：硕士

子宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一。在全球范围内,每年约有20多万女性死于宫颈癌。在发展中国家,宫颈癌则属于常见多发的妇科肿瘤,但其病因尚未完全明确。目前治疗宫颈癌大多采用化学合成药物,在治疗过程中易产生毒副作用和耐药性。... 详细信息

子宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一。在全球范围内,每年约有20多万女性死于宫颈癌。在发展中国家,宫颈癌则属于常见多发的妇科肿瘤,但其病因尚未完全明确。目前治疗宫颈癌大多采用化学合成药物,在治疗过程中易产生毒副作用和耐药性。蛋白类药物以其毒副作用低和不产生耐药性等优点已引起研究者的高度关注。利用生物技术研发蛋白类药物已成为癌症治疗领域中的研究热点。人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)是一种隶属于铁结合蛋白家族的糖基化蛋白。它具有多种生理功能,如抑菌;抗病毒感染作用;调节体内铁的平衡;促进铁的传递和吸收;调节机体免疫功能;增强机体抗病能力等作用。近期的研究表明乳铁蛋白还具有抑制人体多种肿瘤细胞的生长、预防及治疗肿瘤的作用,而对重组人乳铁蛋白(recombinant human lactoferrin, rhLF)抗宫颈癌作用的研究国内外还未见相关报道。本研究分别利用离子交换以及金属螯合法提取转基因羊乳汁中的重组人乳铁蛋白,经过透析、冻干后作用于体外培养的Hela细胞,并对rhLF抗宫颈癌活性及其作用机理进行了研究,获得如下结果。 (1)含有重组人乳铁蛋白的羊乳汁分别用离子交换层析柱和镍螯合的亲和柱进行蛋白分离,洗脱液透析后冻干得到蛋白。经SDS-PAGE电泳检测确定其为重组人乳铁蛋白,得率分别为30%和65%。 (2)Hela细胞培养基中加入100mg/mlrhLF,培养48h后用MTT法检测检测,结果显示rhLF能显著抑制Hela细胞的生长,抑制率达到73.25%。 (3)HE染色、Hoechst染色和TUNEL染色均显示rhLF有诱导Hela细胞凋亡的作用。 (4)细胞周期分析显示,100mg/ml rhLF处理的Hela细胞处于G2/M期细胞数增加,并且出现明显的凋亡峰,表明rhLF可能是通过影响细胞周期来诱导细胞凋亡的。 (5)通过免疫组化检测突变型p53基因及PCNA在rhLF处理Hela细胞中的表达,表明rhLF能够抑制两种基因蛋白的表达。

关键词：重组人乳铁蛋白 Hela细胞宫颈癌凋亡

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重组人神经生长因子β腺病毒的构建及鉴定

安徽农业科学 2008年第2期36卷 457-459,511页

作者：冯波李青旺肖波韩增胜支旭勃西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 燕山大学环化学院生物工程系河北秦皇岛066004

[目的]克隆带有His标签的人神经生长因子β基因(human nerve growth factor beta,hNGF"β),并构建hNGF"β与EGFP基因复制缺陷型腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤的应用研究奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取人胎肝... 详细信息

[目的]克隆带有His标签的人神经生长因子β基因(human nerve growth factor beta,hNGF"β),并构建hNGF"β与EGFP基因复制缺陷型腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤的应用研究奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取人胎肝总RNA,应用RT-PCR方法以自行设计的带有His标签的引物来扩增NGF"β基因;将所扩增的NGF"β基因经酶切、纯化,与IRES-EGFP片段共同插入到Pshuttle-cmv载体中,测序后,利用基因同源重组技术构建hNGF基因的复制缺陷型腺病毒载体AdNGF"β,经鉴定,转染HEK293细胞,观察EGFP表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。[结果]克隆的hNGF基因序列与GenBank中的hNGF基因序列完全一致并在3′端携带上His标签;重组腺病毒载体AdNGF-β经PacⅠ酶切得到大于23.0和4.5或2.9kb大小的2个片段,表明同源重组成功。2种重组腺病毒经脂质体介导转染293细胞后,均可观察到绿色荧光蛋白。收获病毒并测定感染滴度分别为1.00×109和0.99×109pfu/ml。[结论]克隆了带有His标签的hNGF"β基因,并成功构建了重组腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤研究奠定基础。

关键词：人神经生长因子β 基因克隆腺病毒

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转基因羊乳中重组人乳铁蛋白的分离工艺研究

黑龙江畜牧兽医 2008年第5期 83-84页

作者：支旭勃李青旺冯波肖波韩增胜范玉生张婷西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 燕山大学环化学院生物工程系河北秦皇岛066004

人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)是一种隶属于铁结合蛋白家族的糖基化蛋白,具有多种生理功能.随着生物技术的发展,利用转基因技术在动物乳腺中生产重组人乳铁蛋白(recombinant human lactoferrin,rhLF)已成为可能,目前已在鼠、兔、... 详细信息

人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)是一种隶属于铁结合蛋白家族的糖基化蛋白,具有多种生理功能.随着生物技术的发展,利用转基因技术在动物乳腺中生产重组人乳铁蛋白(recombinant human lactoferrin,rhLF)已成为可能,目前已在鼠、兔、羊、牛等动物乳汁中成功地表达了重组人乳铁蛋白.

关键词：人乳铁蛋白转基因技术生产重组分离工艺羊乳动物乳腺糖基化蛋白铁结合蛋白

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海带多糖对猪精子冷冻效果影响的研究

黑龙江畜牧兽医 2008年第7期 39-40页

作者：张婷李青旺张树山支旭勃冯波范玉生西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

精子在冷冻解冻过程中易发生过氧化反应,冷冻解冻后活率、受精率等均大幅下降.海带多糖为褐藻糖胶,是一系列组成相似的杂多糖混合物,具有抗突变和抗脂质过氧化等作用,并且可提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性,对其在很多领域都进行了相关... 详细信息

精子在冷冻解冻过程中易发生过氧化反应,冷冻解冻后活率、受精率等均大幅下降.海带多糖为褐藻糖胶,是一系列组成相似的杂多糖混合物,具有抗突变和抗脂质过氧化等作用,并且可提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性,对其在很多领域都进行了相关的研究和探讨,但在猪精子冷冻方面的应用尚未见相关报道.

关键词：冷冻效果海带多糖猪精子超氧化物歧化酶抗脂质过氧化过氧化反应解冻过程冷冻解冻

马齿苋多糖对四氧嘧啶糖尿病小白鼠的降糖作用

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黑龙江畜牧兽医 2008年第9期 86-88页

作者：范玉生李青旺高大威李瑛支旭勃张婷冯波西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 燕山大学环境与化学工程学院河北秦皇岛066004

马齿苋(Portulaca oleracea L.)是一种药食同源植物,是马齿苋科一年生草本植物马齿苋的干燥地上全草,别名为五行草、酸苋、猪母菜、地马菜、马蛇子菜、长寿菜等,具有抗糖尿病、抗细菌、抗病毒、抗衰老、提高免疫力等功能.马齿苋富含α-... 详细信息

马齿苋(Portulaca oleracea L.)是一种药食同源植物,是马齿苋科一年生草本植物马齿苋的干燥地上全草,别名为五行草、酸苋、猪母菜、地马菜、马蛇子菜、长寿菜等,具有抗糖尿病、抗细菌、抗病毒、抗衰老、提高免疫力等功能.马齿苋富含α-不饱和脂肪酸、β-胡萝卜素、黄酮、香豆素、单萜糖苷、生物碱、多糖等化学成分.马齿苋多糖(POP)具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化等作用,而有关降血糖作用未见相关报道,为深入研究其发挥药理作用的有效成分及降血糖效果,本试验研究了马齿苋多糖对四氧嘧啶糖尿病小白鼠的降血糖作用,现介绍如下.

关键词：马齿苋科抗糖尿病降糖作用四氧嘧啶多糖一年生草本植物小白鼠不饱和脂肪酸

一种快速评估PC12细胞多巴胺分泌量的高效液相检测方法

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中国科技期刊数据库医药 2022年第1期 63-67页

作者：梁强王昭维李倩楠支旭勃赵金礼陕西慧康生物科技有限责任公司陕西西安710000

建立一种能够快速评估多肽或小分子影响PC12细胞模型多巴胺分泌量的检测方法。方法:通过洋地黄皂苷增加细胞膜的通透性,同时给予外源钙离子刺激,流式细胞术检测细胞凋亡水平及细胞内钙离子变化情况,确定洋地黄皂苷通透及钙离子刺激用量... 详细信息

建立一种能够快速评估多肽或小分子影响PC12细胞模型多巴胺分泌量的检测方法。方法:通过洋地黄皂苷增加细胞膜的通透性,同时给予外源钙离子刺激,流式细胞术检测细胞凋亡水平及细胞内钙离子变化情况,确定洋地黄皂苷通透及钙离子刺激用量。采用高效液相色谱法检测PC12细胞上清中分泌的多巴胺含量。结果:⑴ 9 μmol?L-1洋地黄皂苷及10μmol?L-1 Ca2+处理能够刺激PC12细胞多巴胺分泌;⑵ 上述刺激条件下,加入不同浓度的阿基瑞林(又叫六胜肽)可以抑制PC12细胞上清中多巴胺的分泌,其抑制作用随着阿基瑞林的浓度增加而逐渐增强。结论:本研究建立了一种通过HPLC快速检测评估PC12细胞多巴胺分泌量的方法。

关键词： PC12细胞儿茶酚胺多巴胺洋地黄皂苷钙离子阿基瑞林

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阿基瑞林制备方法的改进研究

化学通报 2022年第6期85卷 722-727,641页

作者：梁强王昕郭添杨宝支旭勃李倩楠刘建利张忠旗赵金礼陕西慧康生物科技有限责任公司西安710000

阿基瑞林,又称乙酰基六肽-8、六胜肽等。它作为肉毒毒素的安全替代品,具有显著的抗皱活性,是美妆市场上需求潜力很大的抗皱多肽原料。当前阿基瑞林主要是通过固相合成方法得到的,由于所使用的Rink Amide AM树脂单价高、上载量低,造成了... 详细信息

阿基瑞林,又称乙酰基六肽-8、六胜肽等。它作为肉毒毒素的安全替代品,具有显著的抗皱活性,是美妆市场上需求潜力很大的抗皱多肽原料。当前阿基瑞林主要是通过固相合成方法得到的,由于所使用的Rink Amide AM树脂单价高、上载量低,造成了阿基瑞林原料价格高昂,不利于其大规模生产及推广应用。本文中使用固-液相结合的方法,首先用高上载量、单价低的2-CTC树脂合成六肽片段,六肽片段再经酰胺化处理得阿基瑞林粗品,粗品经纯化后得纯度95%以上的阿基瑞林,收率59.77%。本方法成本低、收率高,为C端酰胺化多肽的合成提供了一种新思路。

关键词：阿基瑞林酰胺化反应差向异构氨基保护与脱保护

三肽D-Trp-Arg-Leu-NH2抑制B16黑色素瘤细胞黑色素合成的机制

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香料香精化妆品 2023年第1期 82-86页

作者：王昭维陈款民支旭勃张忠旗梁强赵金礼陕西慧康生物科技有限责任公司陕西西安710000

为了研究三肽D-Trp-Arg-Leu-NH2(dWRL)对小鼠B16细胞的酪氨酸酶(TYR)活性、黑色素合成及相关基因和蛋白表达的影响,探讨dWRL抑制黑色素生成的可能机制,我们体外培养小鼠B16细胞,采用MTT法测定细胞增殖情况、L-多巴氧化法测定TYR活性、... 详细信息

为了研究三肽D-Trp-Arg-Leu-NH2(dWRL)对小鼠B16细胞的酪氨酸酶(TYR)活性、黑色素合成及相关基因和蛋白表达的影响,探讨dWRL抑制黑色素生成的可能机制,我们体外培养小鼠B16细胞,采用MTT法测定细胞增殖情况、L-多巴氧化法测定TYR活性、氢氧化钠裂解法测定细胞黑色素含量、qRT-PCR和Western Blot法分别检测药物作用后B16细胞中小眼畸形相关转录因子(MITF)、TYR的mRNA和蛋白表达水平。结果显示三肽dWRL在试验浓度范围内可明显抑制α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)诱导的B16细胞内TYR活性、黑色素合成量及MITF、TYR基因及蛋白的表达量,且呈浓度依赖性。所以三肽dWRL在体外能抑制B16细胞黑色素的合成,上述变化可能是通过下调MITF和TYR的基因转录和蛋白表达作用来完成。

关键词：三肽D-Trp-Arg-Leu-NH2 B16细胞 α-黑色素细胞刺激素(α-MSH) 黑色素合成酪氨酸酶

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曲线异形塔无背索斜拉桥温度效应分析

公路 2024年第5期69卷 195-201页

作者：廖仲鸿张永祥龚勃旭赵威中交一公局厦门工程有限公司厦门市361021 长安大学公路学院西安市710064

为分析温度荷载作用下曲线异形塔无背索斜拉桥成桥状态的结构响应,以龙滚河大桥为工程背景,建立桥梁结构有限元模型,分析体系温差、日照温差、索梁(塔)温差对桥塔偏位、主梁线形以及索力的影响。结果表明,体系温差下,桥塔以顺桥向弯曲... 详细信息

为分析温度荷载作用下曲线异形塔无背索斜拉桥成桥状态的结构响应,以龙滚河大桥为工程背景,建立桥梁结构有限元模型,分析体系温差、日照温差、索梁(塔)温差对桥塔偏位、主梁线形以及索力的影响。结果表明,体系温差下,桥塔以顺桥向弯曲变形为主,横桥向弯曲变形较小,主梁竖向变形取决于体系温差下,桥墩的变化情况,在体系降温下,斜拉索S1索力变化最为明显,为成桥索力的1.1%;日照温差下,桥塔对横向温差产生了较高的敏感性,在桥塔纵向温差的影响下,主梁跨中上挠值较桥塔横向温差增大了24%,而斜拉索索力变化幅度与体系温差下索力变化幅度基本相同,仅趋势相反;索梁(塔)温差下,斜拉索索力出现了明显的变化,索力变化幅度可达体系温差下的2倍以上。

关键词：无背索斜拉桥曲线异形塔成桥状态温度效应线形索力有限元分析