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牛支原体可视化重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

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浙江农业学报 2024年第8期 1811-1819页

作者：王健霖田兴苗王景松戴莎莎郭亚男何生虎李继东宁夏大学动物科技学院宁夏农林科学院动物科学研究所

为建立一种对牛支原体高效、快捷的可视化重组酶聚合酶扩增（LFD-RPA）临床诊断方法，以牛支原体uvrc基因序列为靶基因，设计特异性引物和探针，通过筛选引物和探针、优化反应条件，并通过灵敏度、特异性、重复性和临床样本检测试验进... 详细信息

为建立一种对牛支原体高效、快捷的可视化重组酶聚合酶扩增（LFD-RPA）临床诊断方法，以牛支原体uvrc基因序列为靶基因，设计特异性引物和探针，通过筛选引物和探针、优化反应条件，并通过灵敏度、特异性、重复性和临床样本检测试验进行验证。结果显示，该试验建立的牛支原体LFD-RPA最佳引物为F2/R2,最佳反应条件为39℃、 25 min;检测灵敏度可达2.08 copies·μL-1,是普通PCR灵敏度的100倍；与滑液囊支原体、沙门氏菌、绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和产气荚膜梭菌之间无交叉反应；重复性稳定；对50份鼻拭子样本进行检测，阳性率为26%,与我国行业标准PCR检测方法的符合率为89.6%。该试验成功建立了牛支原体LFD-RPA检测方法，该方法具有操作简便、快速、高效、敏感等优点，为牛支原体的临床快速诊断提供了技术支撑。

关键词：牛支原体重组酶聚合酶扩增可视化检测方法

鸡毒支原体和滑液囊支原体双重基础RPA检测方法的建立

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中国兽医科学 2024年第7期54卷 905-914页

作者：田兴苗王健霖戴莎莎郭磊司朵朵龚振兴李继东宁夏大学动物科技学院宁夏银川750021 宁夏晓鸣农牧股份有限公司宁夏银川750011

鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)是对家禽危害最大的两种支原体,本研究拟建立基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的MG、MS双重检测方法。以MG的mgc2基因、MS的vlhA基因为检测靶标设计数对引物,通过筛选得到最佳引物,优化反应时间和反应温... 详细信息

鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)是对家禽危害最大的两种支原体,本研究拟建立基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的MG、MS双重检测方法。以MG的mgc2基因、MS的vlhA基因为检测靶标设计数对引物,通过筛选得到最佳引物,优化反应时间和反应温度以确定最佳反应条件,通过优化MG、MS最佳引物配比确定双重基础RPA的反应体系,并进行灵敏度、特异性、重复性试验,用所建方法对120份临床样品进行检测。结果显示,建立的MG、MS双重基础RPA检测方法在37℃下反应20 min即可完成扩增,其最佳引物配比为0.6∶1.4。以重组质粒为模板时,MG、MS的最低检出限分别为3.75 copies/μL、3.46copies/μL;以基因组DNA为模板时,MG、MS的最低检出限分别为1.23×10^(-3)ng/μL、5.68×10^(-3)ng/μL。该方法具有良好的特异性和稳定性。分别用该方法与OIE推荐的单重PCR方法检测120份临床样品,结果表明,该方法的检出率高于OIE的PCR方法,与OIE的PCR方法一致性较强。上述结果表明,建立的MG、MS双重基础RPA检测方法具有操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好的优点,可实现临床MG、MS感染的鉴别诊断。

关键词：鸡毒支原体滑液囊支原体重组酶聚合酶扩增技术检测方法

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4株滑液囊支原体分离株P80脂蛋白的基因克隆及序列分析

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宁夏大学学报（自然科学版） 2024年第1期45卷 60-68页

作者：田兴苗郭磊王健霖戴莎莎司朵朵龚振兴李继东宁夏大学农学院宁夏银川750021 宁夏晓鸣农牧股份有限公司宁夏银川750011

为研究滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)P80家族脂蛋白的功能及其异同,通过PCR方法从4株滑液囊支原体分离株中分别扩增P80-1,P80-2,P80-3蛋白的基因序列并进行测序,通过生物信息学方法对P80家族脂蛋白的蛋白序列进行分析,寻找保守... 详细信息

为研究滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)P80家族脂蛋白的功能及其异同,通过PCR方法从4株滑液囊支原体分离株中分别扩增P80-1,P80-2,P80-3蛋白的基因序列并进行测序,通过生物信息学方法对P80家族脂蛋白的蛋白序列进行分析,寻找保守结构域、抗原表位,并预测功能.结果表明,P80家族脂蛋白均为碱性亲水性稳定蛋白,在N端具有较强疏水性,只有P80-2蛋白具有跨膜螺旋区;P80家族脂蛋白信号肽的位置与疏水区结果相一致;3条P80蛋白具有12个相同的保守结构域及2~4个不同的结构域;有31~32个抗原表位;二级结构均以α-螺旋和无规则卷曲为主;三级结构预测显示,P80-1蛋白具有ABC转运蛋白的功能,P80-2蛋白为周质结合蛋白Ⅱ型,P80-3蛋白具有细胞黏附功能.研究结果可为MS P80家族脂蛋白功能的深入研究以及MS致病机制、病原诊断和疫苗研制提供参考.

关键词：滑液囊支原体 P80家族脂蛋白基因克隆序列分析

牛疱疹病毒1型bICP27蛋白参与调控干扰素及其转录因子表达的研究

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牛疱疹病毒1型bICP27蛋白参与调控干扰素及其转录因子表达的研究

作者：戴莎莎宁夏大学

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎(IBR)是牛的重要传染病,临床以呼吸道症状为主,伴有结膜炎、乳腺炎、流产等症状。其病原是牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),即牛疱疹病毒1型(BHV-1)。BHV-1感染后可形成免疫抑制,导致牛继发多种病原混合感染,造成死亡率的... 详细信息

牛传染性鼻气管炎(IBR)是牛的重要传染病,临床以呼吸道症状为主,伴有结膜炎、乳腺炎、流产等症状。其病原是牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),即牛疱疹病毒1型(BHV-1)。BHV-1感染后可形成免疫抑制,导致牛继发多种病原混合感染,造成死亡率的上升。BHV-1编码的立早期(IE)基因bICP0、bICP4、bICP27是引起免疫抑制的重要因子,其中bICP27是一种在细胞质和细胞核之间穿梭的病毒早期蛋白,具有广泛的基因表达调控作用。研究显示,疱疹病毒通过IE基因对干扰素(IFN)的产生进行调控,抑制其抗病毒效应,进而促进病毒的复制。因此,本论文旨在研究BHV-1 bICP27基因对IFN及其转录因子的调控作用,为进一步阐明BHV-1利用bICP27蛋白造成免疫抑制的分子机制提供研究基础和参考资料。主要研究内容如下:***-1 bICP27基因缺失毒株的构建在质粒pVAX1的基础上构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的转移载体prPgP;将BHV-1 bICP27基因上下游同源臂依次插入prPgP相应的多克隆位点,得到重组转移载体p△bICP27rPgP;重组转移载体转染感染了 BHV-1的MDBK细胞,通过同源重组敲除bICP27基因;利用GFP标记和细胞病变效应(CPE)筛选、PCR鉴定,获得了 BHV-1 bICP27缺失毒株,命名为 rBHV-1/△bICP27。***27蛋白对IFN及其转录因子mRNA水平的影响将质粒 pBIND-bICP27、重组病毒 rBHV-1/△bICP27、rBHV-1/△bICP27+pBIND-bICP27、亲本病毒BHV-1分别转染或感染MDBK细胞,并设置牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染的细胞作为阳性对照以及未处理的细胞作为阴性对照,48 h后qPCR检测IFN-Ⅰ、IFN-Ⅲ、干扰素调节因子(IRF)、NF-κB的mRNA水平。结果显示,bICP27基因缺失毒株rBHV-1/△bICP27诱导产生的IFN-Ⅰ、IFN-Ⅲ、NF-κB、IRF1/3/7 mRNA水平均高于亲本病毒且差异显著,IKKβ水平则相反。rBHV-1/△bICP27和BHV-1分别感染MDBK细胞,并在24 h内不同时间点收集细胞,检测IFN 等的 mRNA 水平。结果显示,rBHV-1/△bICP27 感染后 IFN-α、IFN-β2、IFN-λ、IRF1 随着时间的增加mRNA水平持续上升,IFN-β1、IFN-β3、NF-κB、IRF3、IRF7则在6～8 h达到高峰后下降,至24 h再次升高,表现出不同的时序特性。***27蛋白与IRF1/3/7相互作用的研究运用CheckMateTM哺乳动物双杂交系统研究bICP27蛋白与IRF的相互作用。PCR扩增bICP27 基因和牛源 IRF1/3/7 基因,构建 pBIND-bICP27、pACT-IRF1、pACT-IRF3 和 pACT-IRF7真核表达质粒;将构建好的质粒转染至HEK 293T细胞中,通过双荧光素酶报告系统检测试剂盒检测荧光素酶活性。结果显示,pBIND-bICP27和pACT-IRF1/3/7转染后没有增强报告基因的表达水平。研究结果证明,BHV-1 bICP27 蛋白能够抑制 IFN-α、IFN-β1、IFN-β2、IFN-β3、IFN-λ、NF-κB、IRF1、IRF3、IRF7的mRNA转录水平,但这种抑制效应可能不通过bICP27与IRF1、IRF3、IRF7的蛋白间相互作用而产生。研究结果为揭示BHV-1的免疫抑制机理提供了参考。

关键词：牛疱疹病毒 bICP27 干扰素干扰素调节因子

热毒宁联合五维赖氨酸颗粒治疗手足口病的疗效及对血清cTnI和CK-MB水平影响

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中华中医药学刊 2022年第4期40卷 176-179页

作者：戴莎莎夏晨南京医科大学附属儿童医院江苏南京210000

目的探讨热毒宁联合五维赖氨酸颗粒治疗手足口病的疗效及对血清cTnI和CK-MB水平影响。方法选取医院收治的手足口病患儿286例,采用随机分为两组各143例。对照组给予五维赖氨酸颗粒,观察组在对照组基础上给予热毒宁注射液,对比两组临床疗... 详细信息

目的探讨热毒宁联合五维赖氨酸颗粒治疗手足口病的疗效及对血清cTnI和CK-MB水平影响。方法选取医院收治的手足口病患儿286例,采用随机分为两组各143例。对照组给予五维赖氨酸颗粒,观察组在对照组基础上给予热毒宁注射液,对比两组临床疗效、临床症状缓解时间和临床症状评分、血清炎性因子、IgA、IgM、IgG水平、细胞免疫因子水平及血清cTnI和CK-MB水平变化。结果治疗后,对照组:显效65例,有效51例,无效27例,治疗有效率为81.12%(116/143);观察组:显效77例,有效60例,无效6例,治疗有效率为95.80%(139/143);观察组治疗有效率明显较高(P0.05);治疗后两组体温、口腔疱疹数和进食情况评分明显降低(P0.05);治疗后两组血清TNF-α、IL-6和IL-10水平明显降低(P0.05);治疗后两组血清cTnI和CK-MB水平明显降低(P0.05);治疗后两组CD_(3)^(+)、CD_(4)^(+)和CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)水平明显升高(P0.05);治疗后两组IgA、IgM、IgG水平明显升高(P<0.05);且观察组升高较明显(P<0.05)。结论采用热毒宁联合五维赖氨酸颗粒治疗手足口病具有较好的临床疗效,可降低血清cTnI和CK-MB水平。

关键词：热毒宁注射液五维赖氨酸颗粒手足口病临床疗效血清cTnI和CK-MB水平

牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gB和gD的研究进展

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福建农业学报 2023年第3期38卷 376-386页

作者：戴莎莎王健霖田兴苗李继东宁夏大学农学院宁夏银川750021

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是牛的重要传染病,临床以呼吸道症状为主,伴有结膜炎、乳腺炎、流产等症状。其病原是牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV),又称牛疱疹病毒1型... 详细信息

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是牛的重要传染病,临床以呼吸道症状为主,伴有结膜炎、乳腺炎、流产等症状。其病原是牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV),又称牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus 1,BHV-1),共编码30~40种结构蛋白,其中11种为囊膜糖蛋白。糖蛋白在病毒吸附、侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。糖蛋白gB对病毒侵入宿主细胞、在细胞间扩散及复制至关重要;糖蛋白gD在病毒复制、传播和感染机制方面作用重大,具有良好的免疫原性,是诱导产生中和抗体的主要糖蛋白。对gB、gD的研究不仅可从蛋白层面解析病毒侵染机制,还能够为牛传染性鼻气管炎的临床诊断和预防提供理论依据。本文针对牛传染性鼻气管炎病毒的主要糖蛋白gB、gD的研究结果进行综述,分析其生物学功能以及在疫苗和诊断方面的应用,以期为牛传染性鼻气管炎侵染机制和防控提供参考。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gB糖蛋白 gD糖蛋白生物学功能诊断疫苗

重组牛疱疹病毒1型转移载体的构建与初步应用

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浙江农业学报 2023年第10期35卷 2311-2320页

作者：戴莎莎马小静王景松田兴苗王健霖李继东宁夏大学动物科技学院宁夏银川750021

为构建一种能用于牛疱疹病毒1型(BHV-1)重组的转移载体,在真核表达载体pVAX1 CMV(cytomegalovirus)启动子的反向位点插入另一个CMV启动子,构建具有双向启动功能的表达载体prPP,在正、反向CMV启动子下游预置多克隆酶切位点;将绿色荧光蛋... 详细信息

为构建一种能用于牛疱疹病毒1型(BHV-1)重组的转移载体,在真核表达载体pVAX1 CMV(cytomegalovirus)启动子的反向位点插入另一个CMV启动子,构建具有双向启动功能的表达载体prPP,在正、反向CMV启动子下游预置多克隆酶切位点;将绿色荧光蛋白标记基因置于反向启动子下,构建BHV-1重组载体prPgP;以BHV-1囊膜糖蛋白基因gE作为重组位点,将gE上下游同源臂插入prPgP载体中,牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E 2基因置于正向CMV启动子下,构建p△gErPgP-E2载体,用重组质粒转染已感染BHV-1的牛肾细胞(MDBK),产生的重组病毒经筛选、纯化、鉴定,命名为rBHV-1-△gE/E2,所含GFP和E 2基因正常表达。结果表明,重组载体prPgP能方便地用于BHV-1的重组,为相关研究及其疫苗研制提供了便捷。

关键词：牛疱疹病毒1型同源臂转移载体同源重组

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1型牛疱疹病毒bICP27蛋白在病毒感染中的作用

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黑龙江畜牧兽医 2023年第2期 37-42页

作者：戴莎莎张金花王天宇雷丽霞李继东宁夏大学农学院银川750021

1型牛疱疹病毒(Bovine herpesvirus type 1,BHV-1)主要感染牛,对牛的呼吸系统、眼结膜、生殖系统和神经系统均有损害。BHV-1编码的牛感染细胞蛋白27(bovine infected cell protein 27,bICP27)是一种可在细胞核和细胞质之间穿梭的立即早... 详细信息

1型牛疱疹病毒(Bovine herpesvirus type 1,BHV-1)主要感染牛,对牛的呼吸系统、眼结膜、生殖系统和神经系统均有损害。BHV-1编码的牛感染细胞蛋白27(bovine infected cell protein 27,bICP27)是一种可在细胞核和细胞质之间穿梭的立即早期(immediate early,IE)蛋白,可以抑制宿主的先天性免疫应答,能够在病毒感染早期刺激病毒蛋白表达,在感染后期促进病毒复制,调控病毒mRNA转录和宿主基因表达。笔者综述了近年来有关bICP27蛋白在BHV-1感染宿主过程中的作用,以期为BHV-1的深入研究提供参考和借鉴。

关键词： 1型牛疱疹病毒牛感染细胞蛋白27 活性调节免疫抑制细胞凋亡

重组人干扰素α1b辅助治疗传染性单核细胞增多症疗效的前瞻性随机对照研究

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中国当代儿科杂志 2020年第9期22卷 953-957页

作者：戴莎莎周凯南京医科大学附属儿童医院感染科江苏南京210000

目的探究重组人干扰素α1b辅助阿昔洛韦治疗对传染性单核细胞增多症(IM)患儿免疫功能、炎症因子及心肌酶谱的影响。方法将2018年1~12月收治入院的182例IM患儿通过随机数字表法分为观察组(n=91)及对照组(n=91)。对照组接受静脉滴注阿昔... 详细信息

目的探究重组人干扰素α1b辅助阿昔洛韦治疗对传染性单核细胞增多症(IM)患儿免疫功能、炎症因子及心肌酶谱的影响。方法将2018年1~12月收治入院的182例IM患儿通过随机数字表法分为观察组(n=91)及对照组(n=91)。对照组接受静脉滴注阿昔洛韦治疗,观察组在对照组基础上雾化吸入重组人干扰素α1b。比较两组患儿临床症状、免疫功能、炎症反应、心肌酶谱及不良反应情况。结果观察组体温恢复正常、咽峡炎消失、颈部淋巴结肿大消失、肝大消失、脾大消失时间均短于对照组(P0.05)。结论重组人干扰素α1b辅助阿昔洛韦治疗能有效改善IM患儿免疫功能,抑制机体炎症反应,减轻心肌损伤,进而缓解患儿临床症状。

关键词：传染性单核细胞增多症重组人干扰素α1b 免疫功能炎症反应心肌酶谱儿童