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结核分枝杆菌WecA膜蛋白的表达和功能分析

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结核分枝杆菌WecA膜蛋白的表达和功能分析

作者：徐立铭大连医科大学

学位级别：硕士

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是结核病的病原体,全世界大约有1/3人口感染或携带这种杆菌。从上世纪末开始,由于耐多药甚至广泛耐药结核分枝杆菌的出现使已经得到控制的结核病发病率又呈现逐年上升趋势。因此,寻找新的抗... 详细信息

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是结核病的病原体,全世界大约有1/3人口感染或携带这种杆菌。从上世纪末开始,由于耐多药甚至广泛耐药结核分枝杆菌的出现使已经得到控制的结核病发病率又呈现逐年上升趋势。因此,寻找新的抗结核药物的靶点是当前结核病研究的主要任务之一。结核分枝杆菌细胞壁具有独特的结构,对于维持细胞的生存和繁殖有非常重要的作用。其细胞壁的核心结构由三种大分子组成,由外至内分别为分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖。其中聚阿拉伯半乳糖与肽聚糖之间是通过L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺（L-rhamnose-D-N-GlcNAc）衔接双糖共价连接起来的,这个衔接双糖对于维持结核分枝杆菌细胞壁的完整性有极其重要的作用。 L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺衔接双糖合成的第一步反应是将糖基供体UDP-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸（GlcNAc-1-P）基团转移到脂类载体C50-P（Decaprenyl phosphaye）上形成C50-P-P-GlcNAc,此反应由N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶催化完成。N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶对于衔接双糖的合成有至关重要的作用,一旦该酶被抑制或缺失,衔接双糖将不能合成。在大肠杆菌中wecA基因编码的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶（WecA）参与脂多糖（LPS）中O-抗原多糖的合成。本实验室通过对大肠杆菌wecA基因敲除菌株MV501中LPS合成的补偿实验,证实了结核分枝杆菌Rv1302基因是WecA的编码基因wecA;并构建了耻垢分枝杆菌wecA基因敲除菌株,通过测定其生长曲线和使用电镜观察其形态学和细胞结构变化,证明了wecA是分枝杆菌生长必需基因。由此可见,WecA是研发抗结核药物的一个非常好的潜在靶点。通过对结核分枝杆菌WecA的结构预测,WecA是一个具有11个跨膜结构域的膜蛋白。由于其结构的复杂性,难于在E. coli宿主细胞中获得高表达的WecA膜蛋白,也不便对WecA膜蛋白进行纯化。目的: 1.用pET16b-Tb wecA表达载体在E. coli ER2566菌株中表达WecA膜蛋白并进行纯化;2.建立WecA酶活性分析方法,分别使用薄层层析（TLC）和高效液相色谱（HPLC）技术对WecA酶活性进行鉴定;3.尝试WecA膜蛋白表达的其它方法,包括构建pCold-Tb wecA表达载体,在E. coli MV501菌株中低温诱导WecA膜蛋白的表达;获取删除5’端的wecA基因,构建pET29b-Tb wecA del1和pET29b-Tb wecA del2表达载体,在多种大肠杆菌表达菌株中表达N末端截短的WecA膜蛋白;使用MembraneMax Protein Expression Kit在体外表达WecA膜蛋白。结果: 1.用pET16b-Tb wecA表达载体在E. coli ER2566菌株中表达WecA膜蛋白并纯化出WecA膜蛋白在25℃条件下用终浓度1 mM的IPTG诱导pET16b-Tb wecA/ER2566生长16 h。用超声方法破碎诱导后的细菌,提取细胞膜组分,用去污剂n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（n-Dodecyl-β-D-maltoside, DDM）溶解膜蛋白,将样品分别进行Dot blot,SDS-PAGE和Western blot分析。从pET16b-Tb wecA/ER2566的膜组分中能够检测到表达的WecA蛋白。用镍-组氨酸亲和层析法对带有N-末端组氨酸标签的WecA融合蛋白进行纯化,对纯化的WecA蛋白进行酶活性分析。 2.建立了WecA酶活性分析方法（1）WecA酶活性检测:TLC法将底物C50-P和UDP-GlcNAc与纯化的WecA蛋白共同孵育,用氯仿/甲醇/氨水抽提有机相并真空干燥。用氯仿溶解样品后,将样品点在TLC板上进行层析,用磷钼酸对脂类进行显色,通过底物C50-P的消耗量和产物C50-P-P-GlcNAc的生成量来确定WecA酶活性。结果显示,用TLC法检测到了纯化的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶活性。（2）WecA酶活性检测:HPLC法将反应底物C50-P和UDP-GlcNAc和纯化的WecA蛋白共同孵育,用氯仿/甲醇/氨水萃取反应液,对水相进行HPLC检测,通过底物UDP-GlcNAc的减少量来确定WecA酶活性。结果显示,纯化的WecA蛋白与底物共同孵育后,底物UDP-GlcNAc有了明显的消耗,峰面积减小了约20%,由此进一步证明了所纯化的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶活性。 3.尝试了WecA膜蛋白表达的其

关键词：结核分枝杆菌 WecA膜蛋白截短的WecA膜蛋白膜蛋白体外表达系统

磁控溅射法AlN/ZnO薄膜的制备及其表征

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磁控溅射法AlN/ZnO薄膜的制备及其表征

作者：徐立铭延边大学

学位级别：硕士

氮化铝(A1N)薄膜是一种重要的Ⅲ-V族半导体,在光学,电学和半导体领域具有很大应用潜能.氮化铝薄膜具有许多突出的物理化学性能,如宽的直接带隙,大的击穿场强,高的热导率,良好的化学稳定性,高表面声波速度,高熔点,低的热膨胀系数等.这些... 详细信息

氮化铝(A1N)薄膜是一种重要的Ⅲ-V族半导体,在光学,电学和半导体领域具有很大应用潜能.氮化铝薄膜具有许多突出的物理化学性能,如宽的直接带隙,大的击穿场强,高的热导率,良好的化学稳定性,高表面声波速度,高熔点,低的热膨胀系数等.这些性质使它成为微电子学和光学领域内光电器件的绝缘层和缓冲层的最佳材料.所以,研究氮化铝薄膜的制备,性能,生长机理及应用都具有重要的意义.A1N和ZnO具有相同的六方纤锌矿结构,两者晶格失配度较小,且热膨胀系数相近,因此在ZnO薄膜上制备高品质的A1N薄膜是可行的. 本文利用磁控溅射方法(Magnetron Sputtering),通过改变实验条件,如：改变气体浓度,溅射压强和溅射功率等,分别在硅衬底上制备了氧化锌薄膜和氮化铝薄膜,然后在氧化锌薄膜上制备了氮化铝薄膜. 利用扫描电子显微镜(SEM)观察了在氧化锌薄膜上制备的氮化铝薄膜的表面形貌,发现薄膜表面的晶粒大小约为1μm,分布均匀,结合致密,呈六角形状.说明我们得到了结晶性良好,结构单一,高度择优取向的氮化铝薄膜. 利用X-射线衍射(XRD)和拉曼(Raman)散射等实验技术,对ZnO,AlN和AlN/ZnO薄膜样品进行了结构表征.表明氧化锌薄膜具有单一c轴取向;通过比较分析,我们得到了在Si基底上制备高度择优取向AlN薄膜的最佳实验条件.通过观察XRD衍射光谱得出AlN/ZnO薄膜结晶良好,具有单一的(002)取向,估算晶粒大小约为1.1μm,这与SEM图像观察得到的结果一致.

关键词：氮化铝氧化锌扫描电子显微镜拉曼散射 X-射线衍射

在Modesto地区夏播条件下莲花某些遗传特性的表现

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武汉植物学研究 1990年第1期8卷 19-24页

作者：黄国振邓惠勤徐立铭中国科学院武汉植物研究所武汉430074

1985年7月3日至8月15日,在美国加利福尼亚州Modesto市太平洋企业公司莲园播种168组莲花种子约1000粒,保存568株苗,有35个组合的56株苗当年开了花,其中部分植株从播种到开花只需30至35天。绝大多数的植株在霜冻期来临之前都能自然结束其... 详细信息

1985年7月3日至8月15日,在美国加利福尼亚州Modesto市太平洋企业公司莲园播种168组莲花种子约1000粒,保存568株苗,有35个组合的56株苗当年开了花,其中部分植株从播种到开花只需30至35天。绝大多数的植株在霜冻期来临之前都能自然结束其年生长期,但有一部分则不能。后者继续旺盛生长,直到霜期到来时叶片被冻死。这些现象表明,莲花的不同遗传类型之间,存在着对日照和温度的不同反应。

关键词：莲属莲花夏季播种遗传型

离心力对制备沉积物间隙水中化合物浓度的影响

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水生生物学报 2003年第5期27卷 487-491页

作者：朱江周永欣葛虹徐立铭张扬中国地质大学工程学院武汉430074 中国科学院水生生物研究所武汉430072 湖北省水产科学研究所武汉430071 中国科学院武汉植物研究所武汉430074

研究了离心力对间隙水化合物浓度的影响。将腐殖质掺入东湖沉积物样品 ,按泥∶水 =1∶4 (体积 )比室温下静置 30d ,随后掺入铜 ,泥∶水 =1∶4 (体积 )比静置 10d ,得到总有机碳含量在 1 4 7%— 5 72 %、铜含量在 12 0— 2 70 0mg/kg(干... 详细信息

研究了离心力对间隙水化合物浓度的影响。将腐殖质掺入东湖沉积物样品 ,按泥∶水 =1∶4 (体积 )比室温下静置 30d ,随后掺入铜 ,泥∶水 =1∶4 (体积 )比静置 10d ,得到总有机碳含量在 1 4 7%— 5 72 %、铜含量在 12 0— 2 70 0mg/kg(干重 )的试验沉积物样品 ,用离心法制备沉积物中的间隙水。离心参数为 30 0 0r/min、5 2 0 0r/min、90 0 0r/min、10 5 0 0r/min和 12 0 0 0r/min ,4℃下离心 2 0min。间隙水中化合物浓度分析表明 ,随离心力升高 ,间隙水中铜、铁、总有机碳 (TOC)含量逐渐降低 ,钙的含量略有增加 ,而锰的含量不受离心力变化的影响。根据上述分析结果 ,确定在腐殖质对沉积物中铜的毒性影响研究中 ,制备沉积物间隙水的适宜离心条件为 :12 0 0 0r/min、4℃下离心 2 0min。

关键词：沉积物间隙水离心力浓度水生态系统

睡莲科的系统发育:核糖体DNA ITS区序列证据

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植物分类学报 2005年第1期43卷 22-30页

作者：刘艳玲徐立铭倪学明赵家荣中国科学院武汉植物园武汉430074

以金鱼藻Ceratophyllum demersum为外类群,使用PAUP4.0b4A软件对睡莲科Nymphaeaceae植物7属11个代表种的ITS区序列进行了系统发育分析。采用最大简约法分析获得了3个最简约树,步长为1125,一致性指数(CI)和维持性指数(RI)值分别为0.7618... 详细信息

以金鱼藻Ceratophyllum demersum为外类群,使用PAUP4.0b4A软件对睡莲科Nymphaeaceae植物7属11个代表种的ITS区序列进行了系统发育分析。采用最大简约法分析获得了3个最简约树,步长为1125,一致性指数(CI)和维持性指数(RI)值分别为0.7618和0.7214。利用3个最简约树获取严格一致树。结果表明:(1)莲属Nelumbo位于系统树的基部,自展支持率为100%,可从睡莲科中独立出来成立莲科Nelumbonaceae和莲目Nelumbonales;(2)萍蓬草属Nuphar是一单系类群,位于分支Ⅱ的基部,并和睡莲科其他属(不包括莲属)植物聚在一起构成姐妹群,故萍蓬草属仍应置于睡莲科中;(3)水盾草属Cabomba和莼菜属Brasenia聚成一小支并构成姐妹群,自展支持率为99%,说明这两属之间亲缘关系较近;(4)睡莲属和芡实属Euryale、王莲属Victoria聚成一小支并构成姐妹群,自展支持率为94%,说明三者亲缘关系较近,仍应置于睡莲科中。

关键词：睡莲科系统发育核糖体DNA ITS序列亲缘关系

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莲SRAP-PCR反应体系的优化与建立

植物科学学报 2012年第1期30卷 85-91页

作者：杨美徐立铭刘艳玲中国科学院水生植物与流域生态重点实验室中国科学院武汉植物园武汉430074

以中国古代莲(Nelumbo nucifera)和美洲黄莲(***)为材料,利用单因素分析法对影响莲SRAP-PCR扩增效果的模板、Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物浓度进行了探索和研究。获得了能稳定扩增莲基因组的SRAP-PCR最佳10μL反应体系:模板DNA浓度... 详细信息

以中国古代莲(Nelumbo nucifera)和美洲黄莲(***)为材料,利用单因素分析法对影响莲SRAP-PCR扩增效果的模板、Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物浓度进行了探索和研究。获得了能稳定扩增莲基因组的SRAP-PCR最佳10μL反应体系:模板DNA浓度为50 ng、1μL 10×Buffer、MgCl2浓度为2 mmol/L、dNTPs浓度为0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶浓度为0.75 U、正反向引物浓度均为0.8μmol/L。为检测该优化体系的稳定性,进一步选取16对引物组合对88份花莲核心种质进行PCR扩增,获得了183条清晰的谱带,其中165条具有多态性,比率为90%,说明建立的莲SRAP反应体系是稳定可靠的。莲SRAP-PCR反应体系的优化和建立,为利用SRAP标记技术深入开展莲的遗传多样性评价、遗传连锁图构建和分子辅助育种等研究提供成熟的技术体系支撑。

关键词：莲 SRAP PCR反应体系优化

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木兰科含笑的细胞学研究

武汉植物学研究 2004年第1期22卷 87-89页

作者：王庆王恒昌徐立铭中国科学院武汉植物园武汉430074

对含笑Micheliafigo(Lour.)Spreng进行了细胞学研究。证实其染色体数目为2n=2x=38,最大与最小染色体长度比率为2.2,没发现st染色体和随体。首次观察和描述了其减数分裂行为。

关键词：木兰科含笑细胞学有丝分裂及减数分裂

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桦木科两种濒危植物的染色体数目

武汉植物学研究 2004年第2期22卷 171-173页

作者：孟爱平何子灿李建强徐立铭中国科学院武汉植物园武汉430074

首次对桦木科濒危物种普陀鹅耳枥和天目铁木进行了细胞学研究。普陀鹅耳枥和天目铁木的间期核和有丝分裂前期染色体均分别为复杂染色中心型和中间型;普陀鹅耳枥的染色体数目为2n=14x=112,染色体大小介于0.230μm至0.920μm之间。天目铁... 详细信息

首次对桦木科濒危物种普陀鹅耳枥和天目铁木进行了细胞学研究。普陀鹅耳枥和天目铁木的间期核和有丝分裂前期染色体均分别为复杂染色中心型和中间型;普陀鹅耳枥的染色体数目为2n=14x=112,染色体大小介于0.230μm至0.920μm之间。天目铁木的染色体数目为2n=2x=16,染色体大小为0.468μm至1.150μm。以上研究结果为濒危物种普陀鹅耳枥和天目铁木的物种生物学及其濒危机制的研究提供了细胞学资料。

关键词：普陀鹅耳枥天目铁木桦木科染色体数目

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观赏莲新品种‘赛凌霄’

园艺学报 2023年第S1期50卷 155-156页

作者：杨东刘艳玲徐立铭杨美湖北省湿地演化与生态恢复重点实验室中国科学院武汉植物园武汉430074 中国科学院武汉植物园水生植物研究中心中国科学院武汉植物园武汉430074

观赏莲‘赛凌霄’是从人工杂交后代中筛选出的重瓣、红色、大型长花期新品种。母本为热带莲‘粉红凌霄’,父本为秋荷‘深秋香荷’。在大田条件下,株高110~165 cm,叶片大小55~70 cm×50~60 cm。着花密度12~14朵·m^(-2),花稍高于叶面,花... 详细信息

观赏莲‘赛凌霄’是从人工杂交后代中筛选出的重瓣、红色、大型长花期新品种。母本为热带莲‘粉红凌霄’,父本为秋荷‘深秋香荷’。在大田条件下,株高110~165 cm,叶片大小55~70 cm×50~60 cm。着花密度12~14朵·m^(-2),花稍高于叶面,花径20~28 cm,花被片236~253枚。青熟莲蓬碗形,地下茎稍许膨大。长江流域地区群体花期6—11月。

关键词：荷花长花期重瓣秋荷品种