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基于NA活性检测细胞基质流感疫苗病毒滴度新方法的建立

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中华微生物学和免疫学杂志 2020年第4期40卷 295-299页

作者：赵慧王剑锋英志芳徐康维李娟李长贵中国食品药品检定研究院呼吸道病毒疫苗室北京102629

目的:建立基于神经氨酸酶(neuraminidase,NA)活性检测细胞基质流感疫苗病毒滴度的新方法,并进行初步应用。方法:对NA活性检测使用底物的浓度和终止液类型、病毒感染靶细胞数目以及细胞裂解剂等反应条件进行优化,采用建立的方法检测细胞... 详细信息

目的:建立基于神经氨酸酶(neuraminidase,NA)活性检测细胞基质流感疫苗病毒滴度的新方法,并进行初步应用。方法:对NA活性检测使用底物的浓度和终止液类型、病毒感染靶细胞数目以及细胞裂解剂等反应条件进行优化,采用建立的方法检测细胞基质培养的流感疫苗毒种的病毒滴度,并与传统的病毒滴定法检测结果进行比较。结果:NA活性检测法的最适底物浓度为25μmol/L,最适终止液为0.2 mol/L Na 2CO 3。细胞数目为4×10^4个/孔,病毒感染48 h后,用0.5%TritonX-100裂解,检测细胞内复制病毒的NA活性,产生的相对荧光值最大。检测4批细胞基质培养的流感疫苗毒种病毒滴度,该方法与传统病毒滴定法检测结果差异无统计学意义(P>0.05),具有较好的一致性。结论:本研究建立了基于NA活性检测细胞基质流感疫苗病毒滴度的新方法,可用于生产过程中细胞基质流感病毒毒种的检定。

关键词：细胞基质流感病毒疫苗病毒滴度试验神经氨酸酶质量控制

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新型冠状病毒灭活疫苗测定能力验证研究

中国药学杂志 2024年第23期 2288-2292页

作者：高晓明徐康维鲁旭乔志中权娅茹李长贵项新华中国食品药品检定研究院

目的通过开展新型冠状病毒灭活疫苗pH值、渗透压摩尔浓度、铝含量的测定能力验证，评价疫苗质控实验室及疫苗生产企业实验室的检测能力。方法采用F检验和t检验对新型冠状病毒灭活疫苗样品开展均匀性和稳定性考察，样品通过均匀性稳定... 详细信息

目的通过开展新型冠状病毒灭活疫苗pH值、渗透压摩尔浓度、铝含量的测定能力验证，评价疫苗质控实验室及疫苗生产企业实验室的检测能力。方法采用F检验和t检验对新型冠状病毒灭活疫苗样品开展均匀性和稳定性考察，样品通过均匀性稳定性检验后冷链运输分发至各参加实验室。以Z比分数评价参加实验室的pH值、渗透压摩尔浓度、铝含量检测能力。结果全国共有30家实验室参加本次能力验证活动，pH值、铝含量考核结果均为满意，2家实验室渗透压摩尔浓度考核结果为不满意，后经参加测量审核，获得满意结果。结论参加本次能力验证的省级疫苗质控实验室以及疫苗生产企业具有较好的检测能力和质控水平。

关键词：新型冠状病毒疫苗 pH值渗透压摩尔浓度铝含量能力验证

人H7N9禽流感疫苗抗血清参考品的快速制备及初步应用

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中华微生物学和免疫学杂志 2014年第2期34卷 146-148页

作者：徐康维邵铭刘书珍李长贵王军志蔡芳高强中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品及其标准化重点实验室北京100050 北京科兴生物制品有限公司

目的以重组H7N9禽流感病毒血凝素（HA）免疫动物后制备抗血清，以应用于单向免疫扩散试验（SRID）对H7N9禽流感疫苗抗原定量。方法以真核表达的HA蛋白免疫绵羊，通过酶联免疫试验及双向免疫扩散试验检测抗体效价。通过优化抗血清使用浓... 详细信息

目的以重组H7N9禽流感病毒血凝素（HA）免疫动物后制备抗血清，以应用于单向免疫扩散试验（SRID）对H7N9禽流感疫苗抗原定量。方法以真核表达的HA蛋白免疫绵羊，通过酶联免疫试验及双向免疫扩散试验检测抗体效价。通过优化抗血清使用浓度，建立检测H7N9禽流感疫苗抗原含量的方法。结果经4次免疫后，抗体滴度达到最高值，效价分别为1：1000000（酶联法）和1：32（双扩法）。以制备的抗血清进行SRID试验，当H7N9病毒抗原浓度为10μg/ml～40μg／ml时，能够形成清晰的沉淀环，其直径与抗原浓度相关性良好。以该法检测6批次H7N9疫苗原液中抗原含量，结果与SDS—PAGE方法结果一致。结论通过免疫重组抗原，及时制备了抗血清参考品，可初步应用于H7N9禽流感疫苗的抗原定量。

关键词：甲型H7N9流感病毒抗血清单向免疫扩散

两种低pH孵放法灭活静注人免疫球蛋白中脂包膜病毒效果比较

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中国生物制品学杂志 2019年第8期32卷 919-922页

作者：王剑锋英志芳徐康维李长贵中国食品药品检定研究院呼吸道病毒疫苗室

目的比较两种低pH孵放法对静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins,IVIG)中脂包膜病毒的灭活效果。方法 IVIG中分别加入两种核酸类型的脂包膜病毒水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)及伪狂犬病毒(pseudorabies viru... 详细信息

目的比较两种低pH孵放法对静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins,IVIG)中脂包膜病毒的灭活效果。方法 IVIG中分别加入两种核酸类型的脂包膜病毒水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)及伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)作为指示病毒,以经典工艺(23~25℃灭活21 d)及新工艺[(37±0. 5)℃灭活9 h]低pH(pH为3. 8~4. 4)孵放法进行病毒灭活,分别检测不同灭活时间的病毒滴度,比较灭活效果。结果经典工艺低pH孵放法对VSV灭活效果≥5. 88 logTCID50/0. 1 mL,对PRV的灭活效果≥6. 00 logTCID50/0. 1 mL,且灭活的样品在敏感细胞盲传3代无细胞病变。新工艺低pH孵放法对VSV灭活效果≥4. 62 logTCID50/0. 1 mL,对PRV的灭活效果≥6. 12 logTCID50/0. 1 mL。结论两种低p H孵放法对指示病毒的灭活能力均符合国家标准,但经典工艺对两种指示病毒的灭活效果好且灭活彻底。

关键词：静注人免疫球蛋白脂包膜病毒低pH孵放法病毒灭活

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新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量检测能力验证

中国药学杂志 2024年第6期59卷 555-558页

作者：徐康维郭君贞高晓明鲁旭权娅茹项新华李长贵中国食品药品检定研究院北京102629 山东省食品药品检验研究院济南250101

目的开展新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量检测能力验证,对参加实验室检测能力进行评价。方法对能力验证用新型冠状病毒灭活疫苗样品进行均匀性和稳定性检验,采用冷链运输方式将新型冠状病毒灭活疫苗样品、参考品及检测试剂盒分发至各参... 详细信息

目的开展新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量检测能力验证,对参加实验室检测能力进行评价。方法对能力验证用新型冠状病毒灭活疫苗样品进行均匀性和稳定性检验,采用冷链运输方式将新型冠状病毒灭活疫苗样品、参考品及检测试剂盒分发至各参加实验室。考察鉴别试验、抗原含量检测和实验室内变异3项指标。结果能力验证样品的均匀性和稳定性符合要求,共有14家实验室参加本次能力验证并按要求报告结果,各实验室3项指标考核结果均为满意。结论参加本次能力验证的我国省级药检机构及灭活疫苗生产企业具有较好的新型冠状病毒灭活疫苗检测能力和质控水平。

关键词：新型冠状病毒灭活疫苗酶联免疫吸附试验能力验证

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B型流感病毒血凝素的纯化

中国生物制品学杂志 2014年第3期27卷 409-411页

作者：徐康维黄金凤许凯李娟邵铭刘书珍王军志李长贵中国食品药品检定研究院呼吸道病毒疫苗室卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050 北京科兴生物制品有限公司研发部北京100085

目的纯化B型流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）。方法使用不同浓度的菠萝蛋白酶酶切B型流感病毒HA，超速离心获得含HA的上清后，经蔗糖密度梯度离心进行纯化，HPLC分子筛分析纯化效果。纯化后的蛋白经糖苷酶PNGaseF处理后，切取丰度... 详细信息

目的纯化B型流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）。方法使用不同浓度的菠萝蛋白酶酶切B型流感病毒HA，超速离心获得含HA的上清后，经蔗糖密度梯度离心进行纯化，HPLC分子筛分析纯化效果。纯化后的蛋白经糖苷酶PNGaseF处理后，切取丰度较高的蛋白条带，进行质谱鉴定。结果病毒蛋白与菠萝蛋白酶蛋白含量的最佳比例为40：1；5％-30％梯度浓度的蔗糖能很好地去除低相对分子质量的蛋白，流感病毒内丰度较高的NP及M蛋白得到很好的去除；纯化的HA蛋白的纯度大于90％，且HPLC分析显示仅有1个主峰，均一性良好。结论优化了B型流感病毒HA蔗糖密度梯度离心纯化方法，获得了高纯度的HA蛋白，为制备HA标准抗血清奠定了基础。

关键词：流感病毒血凝素纯化

2011年流感疫苗批签发情况总结与质量分析

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中国生物制品学杂志 2012年第9期25卷 1242-1244页

作者：邵铭刘书珍邱平刘长暖袁力勇徐康维李长贵中国食品药品检定研究院病毒三室北京100050

流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道感染疾病。据统计,全球每年约有5%～15%的人口感染流感病毒,并导致300万～500万的严重病例和约50万的死亡病例。接种流感疫苗是预防流感发生与传播的有效手段。我国自2006年起对流... 详细信息

流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道感染疾病。据统计,全球每年约有5%～15%的人口感染流感病毒,并导致300万～500万的严重病例和约50万的死亡病例。接种流感疫苗是预防流感发生与传播的有效手段。我国自2006年起对流感疫苗实行批签发。

关键词：流感疫苗批签发血凝素质量分析

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新型冠状病毒S蛋白抗体的制备及初步应用

中国生物制品学杂志 2021年第7期34卷 857-861页

作者：徐康维何蕊权娅茹苏喆王剑锋赵慧李长贵中国食品药品检定研究院呼吸道病毒疫苗室北京102629 北京生物制品研究所有限责任公司质量检定室北京100176 天津市药品检验研究院生化室天津300070

目的制备新型冠状病毒S蛋白抗体,初步建立检测新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量的方法。方法使用新型冠状病毒重组S蛋白分别免疫羊和兔,获得抗血清。采用间接ELISA法和微量中和试验检测抗血清效价,免疫印迹试验检测抗体特异性。采用蛋白G... 详细信息

目的制备新型冠状病毒S蛋白抗体,初步建立检测新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量的方法。方法使用新型冠状病毒重组S蛋白分别免疫羊和兔,获得抗血清。采用间接ELISA法和微量中和试验检测抗血清效价,免疫印迹试验检测抗体特异性。采用蛋白G纯化树脂分别对羊和兔抗血清进行亲和层析纯化,获得抗体。以纯化后的羊抗体作为包被抗体,兔抗体作为显示抗体,建立新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量检测方法。结果对羊进行4次免疫后,抗血清ELISA效价达220000,中和抗体效价达1536。对兔进行3次免疫后,抗血清ELISA效价达220000,中和抗体效价达4096。羊和兔抗体均可与新型冠状病毒S蛋白特异性结合。应用纯化后的抗体,成功建立了检测抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,该方法线性良好,R^(2)>0.99,可用于新型冠状病毒灭活疫苗原液抗原含量的检测。结论成功制备了羊和兔抗新型冠状病毒S蛋白高效价抗体,并初步建立了新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法。

关键词：新型冠状病毒抗血清效价酶联免疫吸附试验抗原含量

人甲型H7N9禽流感全病毒灭活疫苗在小鼠中的免疫原性

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中国生物制品学杂志 2016年第5期29卷 455-457页

作者：徐康维于丹邵铭刘书珍高强李长贵中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050 北京科兴生物制品有限公司北京100085

目的评价人甲型H7N9禽流感全病毒灭活疫苗在小鼠中的免疫原性。方法分别将H7N9与H1N1、H5N1全病毒灭活疫苗稀释至血凝素抗原(hemagglutinin,HA)浓度分别为30、6、1.2、0.24和0.048μg/ml后,免疫BALB/c小鼠,各10只,0.5 ml/只,采用血凝抑... 详细信息

目的评价人甲型H7N9禽流感全病毒灭活疫苗在小鼠中的免疫原性。方法分别将H7N9与H1N1、H5N1全病毒灭活疫苗稀释至血凝素抗原(hemagglutinin,HA)浓度分别为30、6、1.2、0.24和0.048μg/ml后,免疫BALB/c小鼠,各10只,0.5 ml/只,采用血凝抑制(hemagglutinin inhibition,HI)试验检测免疫后小鼠血清抗体滴度,计算抗体几何平均滴度(GMT)及半数有效剂量(ED_(50)),并检测免疫后小鼠血清对其他亚型病毒的HI滴度。结果 H7N9组小鼠阳转率与H1N1组较相近,仅H7N9 0.6μg剂量组GMT明显低于H1N1同剂量组(P0.05);H7N9与H1N1、H5N1全病毒灭活疫苗免疫小鼠ED_(50)分别为0.27、0.12和15μg HA。免疫后血清对其他亚型病毒无交叉反应。结论 H7N9疫苗在小鼠中的免疫原性略低于H1N1疫苗,但明显优于H5N1疫苗。

关键词： H7N9 流感疫苗小鼠免疫原性