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病毒学报 2017年第2期33卷 136-141页

作者：徐妍妍周国平徐华国南京医科大学第一附属医院检验学部南京210029 南京医科大学第一附属医院儿科南京210029

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV),又称人类疱疹病毒8型(Human herpesvirus 8,HHV-8),是艾滋病感染者中发病率最高的肿瘤-卡波氏肉瘤的致病性病原体。本实验对KSHV裂解期蛋白-病毒白细胞介素6(Vir... 详细信息

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV),又称人类疱疹病毒8型(Human herpesvirus 8,HHV-8),是艾滋病感染者中发病率最高的肿瘤-卡波氏肉瘤的致病性病原体。本实验对KSHV裂解期蛋白-病毒白细胞介素6(Viral interleukin-6,vIL-6)抑制宿主固有免疫机制进行初步探讨。利用仙台病毒刺激人胚肾细胞(HEK293T)激活抗病毒固有免疫,观察vIL-6过表达后对IFN-β的作用及机制,利用实时定量PCR检测IFN-β基因表达及双荧光素酶实验分析IFN-β基因启动子的活性。过表达vIL-6后,IFN-β基因mRNA水平表达明显下降,进一步实验证明vIL-6可抑制IFN-β基因启动子活性,且vIL-6可特异性作用于IFN-β基因启动子PRDIII-PRDI区。本研究首次证实了KSHV vIL-6可通过抑制IFN-β启动子活性从而调控IFN-β表达,且这种作用主要通过IRF-3信号途径。

关键词：卡波氏肉瘤相关疱疹病毒病毒白细胞介素6 β-干扰素干扰素调节因子3 固有免疫

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人cGAS基因启动子的克隆鉴定及功能初探

南京医科大学学报（自然科学版） 2019年第6期39卷 856-861页

作者：陈海燕徐妍妍周国平徐华国南京医科大学第一附属医院检验学部南京医科大学第一附属医院儿科江苏南京210029

目的:构建人环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,cGAS)基因启动子,确认其活性,进而对转录调控机制进行初步探究。方法:采用PCR方法扩增人cGAS基因5′上游1 254 bp(-1 178^+76 bp)的片段,酶切后连接到pGL3-basic质粒,以该质粒为模板合成不同长度的启动子质粒。通过双荧光素酶报告基因实验验证不同质粒在Hela细胞中的活性,利用生物信息学方法预测启动子区存在的转录因子结合位点。通过点突变实验验证潜在的转录因子结合位点。结果:人cGAS启动子质粒初步构建成功。转染后,cGAS启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加(P<0.05)。人cGAS近端启动子区域(-414^+76 bp)经生物信息学软件分析可能含有Sp1、CREB、USF1、RAP1、C-JUN、OCT-1等转录因子的结合位点。点突变实验证实Sp1、CREB正向调控该启动子区域。结论:人cGAS近端启动子区域(-414^+76bp)存在较强的启动子活性,该区域含有多个潜在的转录因子结合位点。转录因子Sp1、CREB调控人cGAS启动子区。

关键词：环鸟苷酸-腺苷酸合成酶启动子转录调控

小鼠STING基因启动子的克隆鉴定及功能初步分析

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南京医科大学学报（自然科学版） 2016年第7期36卷 783-787,810页

作者：徐妍妍王艳艳徐华国周国平南京医科大学第一附属医院儿科江苏南京210029 南京医科大学第一附属医院检验医学部江苏南京210029

目的 :克隆小鼠干扰素基因刺激因子(STING)基因启动子,并对其启动子活性和转录调控机制进行初步探讨。方法 :利用PCR方法扩增小鼠STING基因5′上游1 005 bp(-927^+77)的片段,亚克隆至p GL3-basic质粒,然后通过步移缺失构建不同缺失片段... 详细信息

目的 :克隆小鼠干扰素基因刺激因子(STING)基因启动子,并对其启动子活性和转录调控机制进行初步探讨。方法 :利用PCR方法扩增小鼠STING基因5′上游1 005 bp(-927^+77)的片段,亚克隆至p GL3-basic质粒,然后通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒。双荧光素酶报告活性分析检测重组质粒在NIH3T3中的活性,并利用生物信息学方法预测转录因子结合位点。结果:经酶切、测序鉴定,成功构建了小鼠STING启动子荧光素酶报告基因重组质粒。与p GL3-basic质粒相比,STING启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加(P<0.05)。通过生物信息学软件预测小鼠STING启动子区域(-177^-48)可能含有GATA、IK2、MZF1、SP1/SP3、STAT等转录因子结合位点。结论:成功构建小鼠STING不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒。通过活性比较,推测小鼠STING的核心启动子区位于-177^+77区域,其中可能含有多个潜在的转录因子结合序列。

关键词：干扰素基因刺激因子(STING) 启动子转录调控

一种新的干扰素基因刺激因子剪接异构体STING(sv)的结构和功能

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病毒学报 2015年第5期31卷 494-499页

作者：王艳艳金蕊周国平徐华国南京医科大学第一附属医院检验学部南京210029 南京医科大学第一附属医院儿科南京210029

干扰素基因刺激因子（Stimulator of interferon genes,STING）是病毒感染后机体抗病毒固有免疫反应过程中的重要蛋白分子。为了寻找STING新的剪接异构体,我们抽提了人类胚胎肾（Human embryonic kidney,HEK）293细胞RNA,用全长STING的m... 详细信息

干扰素基因刺激因子（Stimulator of interferon genes,STING）是病毒感染后机体抗病毒固有免疫反应过程中的重要蛋白分子。为了寻找STING新的剪接异构体,我们抽提了人类胚胎肾（Human embryonic kidney,HEK）293细胞RNA,用全长STING的mRNA（NM-198282.82）序列设计引物,作cDNA末端快速放大（RACE）及RTPCR,生物信息学方法比较新序列,亚克隆STING野生型（wt）及STING剪接异构体（sv）至真核表达载体pEGFPC1和pcDNA 3.1中。质粒EGFP-STING（wt）和EGFP-STING（sv）转染HEK 293细胞,用抗EGFP抗体作Western blot分析;质粒pcDNA-STING（wt）和pcDNA-STING（sv）转染HEK 293细胞,作荧光素酶功能分析以检测新剪接异构体对病毒诱导的干扰素β启动子荧光素酶活性的影响。我们发现了STING 3′端新的剪接异构体,与野生型相比,它缺失了第7外显子,导致阅读框架移位,相应蛋白质的C端30个氨基酸不同于野生型。Western blot出现相对分子质量（Mr）为58×103的STING（sv）蛋白强阳性条带。STING（sv）荧光素酶功能分析显示,该剪接异构体能明显抑制病毒诱导的干扰素β启动子活性。STING（sv）在多数组织和不同细胞系中都能表达。STING（sv）的发现为STING这一重要分子的功能调节提供了新的线索,它可能是病毒感染通路中干扰素的显性负性抑制剂,提示其为干扰素产生的精细调节成分,在人类病毒感染性疾病中的病理意义值得探究。

关键词：干扰素基因刺激因子剪接异构体基因转录调节

人干扰素基因刺激因子(STING)基因沉默子的克隆鉴定及功能初探

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中华微生物学和免疫学杂志 2021年第5期41卷 353-360页

作者：庞晓雨陈海燕陈林媛徐华国南京医科大学第一附属医院检验学部 210029

目的:构建人干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)沉默子的荧光素酶报告质粒,在人胚肾细胞(HEK293T)和人类宫颈癌细胞(HeLa)中检测荧光素酶活性,生物信息学预测其可能结合的转录因子并通过实验验证。方法:通过PCR... 详细信息

目的:构建人干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)沉默子的荧光素酶报告质粒,在人胚肾细胞(HEK293T)和人类宫颈癌细胞(HeLa)中检测荧光素酶活性,生物信息学预测其可能结合的转录因子并通过实验验证。方法:通过PCR扩增人STING-5-1a(-124~+267,相对于转录起始位点,TSS:0)和STING-5-2a(-124~+168)区域,亚克隆至pGL3-Basic质粒;将人STING沉默子区域STING-5-1b(+169~+267)正向反向亚克隆至pGL3-Control质粒(pGL3-C-5-1b-positive/negative),并把STING-5-1b分为两段互补片段,亚克隆至pGL3-Control载体上,命名为pGL3-C-STING-5-1b-α(+169~+209)/pGL3-C-STING-5-1b-β(+210~+267),双荧光素酶报告活性分析检测上述重组质粒在HEK293T和HeLa中的活性。应用生物信息学方法预测人STING沉默子的转录因子结合位点,将预测结合位点进行多点突变,检测荧光素酶活性。敲低转录因子,免疫印迹试验检测STING的表达水平。染色体免疫共沉淀反应进一步验证转录因子与人STING沉默子的结合。结果:核酸测序证实,上述重组质粒构建成功。截短STING-5-1b(+169~+267)片段后相对荧光素酶活性上升。同时,与pGL3-Control质粒相比,pGL3-C-5-1b-positive重组质粒的相对荧光素酶活性下降(P<0.05),其中,STING-5-1b-β(+210~+267)序列起主要抑制作用。应用生物信息学软件预测发现转录因子PR结构域锌指蛋白4(PRDM4)、Thanatos相关蛋白1(THAP1)、TEA域转录因子1(TEAD1)、核受体亚家族4 A组成员1(NR4A1)、类Krueppel因子4(KLF4)和叉头转录蛋白O3(FOXO3)可能与人STING沉默子区域(+210~+267)结合。对上述转录因子的结合位点进行多点突变构建突变体并转染至HEK293T和HeLa,发现THAP1-Mut和TEAD1-Mut的相对荧光素酶活性显著上升,提示STING沉默子可能含有THAP1和TEAD1的结合位点。将转录因子THAP1和TEAD1敲低后,STING的表达水平有显著上升。染色体免疫共沉淀试验表明,转录因子TEAD1和THAP1在细胞内与人STING沉默子区域结合。结论:本实验成功构建了人STING沉默子荧光素酶报告质粒,通过活性比较,推测人STING的核心沉默子区位于+210~+267区域,通过生物信息学分析及点突变实验初步确定人STING沉默子可能含有的潜在转录因子结合位点。并使用免疫印迹试验和染色体免疫共沉淀进一步证实转录因子TEAD1和THAP1与人STING沉默子的结合,为后续研究提供实验资料。

关键词：干扰素基因刺激因子沉默子转录调控

肾透明细胞癌患者肾组织干扰素调节因子6基因启动子区甲基化与总生存率的相关性研究

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中华医学遗传学杂志 2024年第2期41卷 150-156页

作者：张洁心陈灿卫宇昂陈林媛邵鹏飞徐华国南京医科大学第一附属医院检验学部南京210029 南京医科大学第一附属医院泌尿外科南京210029

目的探讨干扰素调节因子6(IRF6)基因启动子甲基化在判断肾透明细胞癌(KIRC)患者预后中的价值。方法收集2016年1月至2020年1月在南京医科大学第一附属医院首诊的50例KIRC患者的原发灶组织,采用免疫组化法检测其IRF6蛋白的表达情况,并分析... 详细信息

目的探讨干扰素调节因子6(IRF6)基因启动子甲基化在判断肾透明细胞癌(KIRC)患者预后中的价值。方法收集2016年1月至2020年1月在南京医科大学第一附属医院首诊的50例KIRC患者的原发灶组织,采用免疫组化法检测其IRF6蛋白的表达情况,并分析IRF6表达水平与患者生存及肿瘤转移的关系。使用生物信息学方法分别比较KIRC和正常肾组织中IRF6的mRNA及蛋白水平差异,基于大数据库分析癌和癌旁组织中IRF6基因启动子区甲基化率差异;将IRF6基因启动子区甲基化状态与患者总生存率(OS)进行统计分析,筛选出呈现显著负相关的区域,利用细胞系体外验证该启动子区甲基化区域与IRF6转录水平的关系。结果KIRC组织中IRF6 mRNA和蛋白水平均显著低于正常样本(P<0.05),该现象在死亡或发生肿瘤转移的KIRC患者中较为突出。KIRC组织中IRF6基因启动子区甲基化程度远高于临近正常肾组织,并且IRF6基因启动子区甲基化与IRF6 mRNA之间存在显著负相关性(R=-0.52)。IRF6基因启动子区域cg12034118和cg16030177的甲基化程度越高,患者OS越短且预后越差;体外KIRC细胞系实验证实,仅cg12034118中有20个CpG位点呈高度甲基化,使用去甲基化试剂5-Aza-CdR处理KIRC细胞系后IRF6转录水平可呈时间和剂量依赖显著性上调(P<0.05)。结论KIRC患者肾组织中IRF6基因启动子区甲基化与OS密切相关。cg12034118提示可作为供实验室检测的生物标志物,其高甲基化率对KIRC患者的预后判断有一定参考价值。

关键词：干扰素调节因子6 肾透明细胞癌甲基化总生存率

小鼠干扰素调节因子3启动子质粒的构建及其启动子活性分析

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江苏医药 2012年第2期38卷 134-136页

作者：刘立飞杨婷婷徐华国周国平南京医科大学第一附属医院儿科江苏省210029

目的构建包含小鼠干扰素调节因子3(mIRF-3)基因启动子的质粒,并评价其启动子活性。方法以小鼠全血细胞总DNA为模板,PCR扩增mIRF-3目的片段,亚克隆此片段至pGL3-basic荧光素酶报告基因的多克隆位点,构建含mIRF-3启动子的重组报告质粒pmIR... 详细信息

目的构建包含小鼠干扰素调节因子3(mIRF-3)基因启动子的质粒,并评价其启动子活性。方法以小鼠全血细胞总DNA为模板,PCR扩增mIRF-3目的片段,亚克隆此片段至pGL3-basic荧光素酶报告基因的多克隆位点,构建含mIRF-3启动子的重组报告质粒pmIRF-3。将pmIRF-3、pGL3-basic和pGL3-control质粒分别转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU)。生物信息学分析转录因子结合位点。结果成功构建了重组报告质粒pmIRF-3。与pGL3-basic组相比,pmIRF-3、pGL3-control组RLU明显增加(0.443±0.113vs.18.907±3.335、25.704±5.850)(P<0.01)。mIRF-3启动子区域内存在AML-1a、E2F、MZF1、CdxA、OCT-x等多个转录因子结合位点。结论 mIRF-3转录起始位点附近1479bp序列在NIH3T3细胞中具有较强的启动子活性。

关键词：干扰素调节因子3 启动子活性

人骨碱性磷酸酶基因启动子的克隆及高水平尿酸对其活性影响的实验研究

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国际检验医学杂志 2020年第13期41卷 1585-1588页

作者：田民杰徐华国南京医科大学第一附属医院检验学部江苏南京210029 南京市江宁医院检验科江苏南京211100

目的克隆人骨碱性磷酸酶(BALP)基因的启动子序列并构建荧光素酶报告基因重组质粒,初步探索高水平尿酸(UA)对BALP基因启动子活性是否产生影响。方法首先用聚合酶链反应扩增目的基因5′端侧翼上游627 bp(距转录起始位点-473 bp至154 bp)... 详细信息

目的克隆人骨碱性磷酸酶(BALP)基因的启动子序列并构建荧光素酶报告基因重组质粒,初步探索高水平尿酸(UA)对BALP基因启动子活性是否产生影响。方法首先用聚合酶链反应扩增目的基因5′端侧翼上游627 bp(距转录起始位点-473 bp至154 bp)的片段,纯化扩增产物后行双酶切,后亚克隆至pGL3-basic质粒,构建BALP基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒。通过质粒转染到HEK293细胞内,最后借助双荧光素酶报告基因活性检测的方法,比较3种UA水平条件下(0.0、0.2和0.4 mmol/L)对基因启动子活性的影响。结果通过双酶切电泳、基因组测序比对分析,成功构建了BALP启动子荧光素酶报告基因重组质粒。随着UA水平的升高,HEK293细胞中启动子重组质粒的相对荧光素酶活性明显降低,差异有统计学差异(P<0.05)。结论高水平UA能够抑制BALP基因启动子的活性。

关键词：高水平尿酸骨碱性磷酸酶骨转移

流动聚焦型微流控体系中的液滴的图案化排列模式和转变

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流动聚焦型微流控体系中的液滴的图案化排列模式和转变