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灰树花一级菌及栽培菌种培养基的筛选优化

北方园艺 2010年第7期 167-168页

作者：律凤霞牡丹江师范学院生物系黑龙江牡丹江157012

以PDA培养基为基础培养基,添加不同比例麸皮饱和溶液,比较灰树花一级种生长情况;同时以北方常用的木屑培养基为对照,添加不同比例玉米面和麸皮,比较灰树花栽培种生长情况及后期子实体原基出现情况。结果表明:添加8%比例麸皮的培养基中... 详细信息

以PDA培养基为基础培养基,添加不同比例麸皮饱和溶液,比较灰树花一级种生长情况;同时以北方常用的木屑培养基为对照,添加不同比例玉米面和麸皮,比较灰树花栽培种生长情况及后期子实体原基出现情况。结果表明:添加8%比例麸皮的培养基中一级种菌丝生长速度快,菌丝粗壮;而栽培种培养基筛选中配方3的菌丝生长速度快,且子实体原基出现较早。

关键词：灰树花培养基筛选优化

RNA干涉技术在烟草抗TMV病毒育种中的应用

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RNA干涉技术在烟草抗TMV病毒育种中的应用

作者：律凤霞黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

烟草病毒病是世界各烟草产区普遍发生的一类主要病害,也是其它农作物的主要侵染毒源,其种类多,危害严重。生产中常以选用抗病品种作为主要防治手段,但抗病品种存在抗性单一、抗性资源狭窄等局限,不能持久、有效地控制病毒危害。RNA干涉... 详细信息

烟草病毒病是世界各烟草产区普遍发生的一类主要病害,也是其它农作物的主要侵染毒源,其种类多,危害严重。生产中常以选用抗病品种作为主要防治手段,但抗病品种存在抗性单一、抗性资源狭窄等局限,不能持久、有效地控制病毒危害。RNA干涉技术为病毒病害的防治开拓了一条新机制。本试验依据RNAi机制,以TMV复制酶基因部分序列为靶序列,经反向重复连接构建到含35S超强启动子的表达载体,转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌LBA4404中,完成植物双元表达载体系统构建。经叶盘法转化获得11株转基因烟草苗。经人工接毒验证,其中7株对TMV具有免疫级抗性。初步证实了RNAi在增强植物抵抗病毒能力方面的显著效果。试验主要内容包括:1.目的基因靶序列的克隆首先对TMV 5种分离株复制酶基因序列进行BlastP序列比对,寻找保守序列,确定进行RNAi的靶序列,设计靶序列引物TMV-r1/TMV-r2。从黑龙江省烟草研究所试验场采集感染普通花叶病的烟草幼嫩叶片,提取TMV总RNA,经RT-PCR获得复制酶基因cDNA序列,应用靶序列引物TMV-r1/TMV-r2进行PCR扩增,产物连接到pMD18-T Simple Vector,转化到大肠杆菌中扩繁,获得RNAi靶序列。***双元载体系统构建利用RNAi载体多克隆位点及目的序列边缘的相同酶切位点,采用酶切后连接方法,成功构建含TMV-r序列反向重复结构的中间载体(pUCCRNAi-TMV2)和表达载体(pC2300-35S-OCS-TMV)。经特异引物PCR扩增验证、限制性内切酶酶切验证,证实连接正确后经大肠杆菌扩繁,成功完成RNAi双元载体系统构建。3.农杆菌介导法转化烟草通过叶盘法,RNAi工程农杆菌侵染无菌烟草组培苗,通过添加卡那霉素的选择培养基,成功筛选出23株卡那抗性个体,将抗性转化植株移栽到温室培养。4.转基因烟草的分子生物学检测及抗性验证改良CTAB法提取抗性烟草DNA,分别以TMV-r1/TMV-r2引物、35S-A/35S-B引物对抗性材料进行常规PCR鉴定,确定了11株阳性转基因烟草苗。利用人工接种TMV进行转化材料的抗病性鉴定。结果表明:与转TMV复制酶全基因的阳性对照品种和非转化材料阴性对照相比,RNAi转基因个体的抗病性明显高于对照,其中7株达到免疫级水平。***效果的荧光定量PCR分析选择表现免疫级抗性的转基因烟草苗4株,转TMV复制酶全基因苗1株,非转基因普通烟草苗3株,分别提取各自总RNA,经荧光定量PCR反应分析植株体内病毒复制酶基因mRNA拷贝数。分析结果证实:出现RNAi效果的转基因烟草中,病毒复制酶基因mRNA拷贝数明显低于其他对照品种,证实了RNAi转基因烟草对人工接种TMV的抗性源于RNAi引起的病毒基因转录产物mRNA的降解。为RNAi技术在抗病毒育种中应用提供理论依据。

关键词： RNA干涉烟草花叶病毒载体构建基因转化

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根癌农杆菌介导外源基因转化烟草体系的优化

安徽农业科学 2010年第19期38卷 10065-10066页

作者：律凤霞牡丹江师范学院生命科学与技术学院黑龙江牡丹江157012

[目的]为了建立优化的根癌农杆菌介导的烟草外源基因转化体系,提高烟草外源基因转化率。[方法]以无菌烟草苗叶盘预培养时间和农杆菌与烟草叶盘的共培养条件为试验要素,筛选适宜的预培养时间和共培养条件范围,其余操作按常规步骤进行。[... 详细信息

[目的]为了建立优化的根癌农杆菌介导的烟草外源基因转化体系,提高烟草外源基因转化率。[方法]以无菌烟草苗叶盘预培养时间和农杆菌与烟草叶盘的共培养条件为试验要素,筛选适宜的预培养时间和共培养条件范围,其余操作按常规步骤进行。[结果]烟草叶盘的预培养适宜时间为27℃下35～40h;农杆菌与烟草叶盘共培养的适宜条件为22～24℃下共培养30～45h,其中23℃下共培养45h效果最佳;之后转入选择培养基内培养。[结论]该研究可为烟草外源基因的转化提供理论依据。

关键词：烟草外植体根癌农杆菌体系优化

携带黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的双元载体构建

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北方园艺 2010年第12期 135-137页

作者：律凤霞牡丹江师范学院生命科学与技术学院黑龙江牡丹江157012

以黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因为目的基因,以大肠杆菌DH5α为表达载体体外操作寄主菌,农杆菌LBA4404为最终双元载体寄主菌。将RT-PCR获得的目的基因片段连接到pMD18-Tsi mple Vectoer上,冻融法转化到大肠杆菌扩繁后,经限制性核酸内切酶酶... 详细信息

以黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因为目的基因,以大肠杆菌DH5α为表达载体体外操作寄主菌,农杆菌LBA4404为最终双元载体寄主菌。将RT-PCR获得的目的基因片段连接到pMD18-Tsi mple Vectoer上,冻融法转化到大肠杆菌扩繁后,经限制性核酸内切酶酶切插入表达载体适宜酶切位点上,重组质粒DNA经冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中得到工程菌,完成含目的基因的双元载体构建,为培育抗CMV病毒的番茄品种打下基础。

关键词：黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因双元载体载体构建

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榆黄蘑菌糠在番茄无土栽培中的应用研究

北方园艺 2013年第8期 159-161页

作者：律凤霞李猷高璿濛牡丹江师范学院生命科学与技术学院黑龙江牡丹江157011

以榆黄蘑菌糠消毒后滤出浸提液为试材,以番茄为无土栽培为试验对象,研究了浸提液在番茄无土栽培中的营养价值。结果表明:与清水比较,榆黄蘑菌糠浸提液中的营养物质对番茄生长过程中的株高、茎粗、冠幅及终产量等都有明显的促进作用。

关键词：菌糠浸提液无土栽培番茄

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不同培养基和不同温度对滑菇菌丝生长的影响

北方园艺 2009年第6期 216-217页

作者：赵桂云弥春霞律凤霞陈欢牡丹江师范学院生物系黑龙江牡丹江157012

在滑菇生产过程中,若单核菌丝出现的多就会影响滑菇的产量。针对这一问题研究了培养基和温度2种因素对滑菇菌丝生长的影响,以便对单核菌丝的生长加以控制,同时促进双核菌丝的增殖。结果表明:采用3号和4号培养基,在25℃下培养,不仅能比... 详细信息

在滑菇生产过程中,若单核菌丝出现的多就会影响滑菇的产量。针对这一问题研究了培养基和温度2种因素对滑菇菌丝生长的影响,以便对单核菌丝的生长加以控制,同时促进双核菌丝的增殖。结果表明:采用3号和4号培养基,在25℃下培养,不仅能比较有效的抑制单核菌丝的产生,而且能促进双核菌丝的生长。

关键词：培养基温度滑菇菌丝影响

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外源RNA干涉基因在烟草中的转化及表达

西北植物学报 2009年第10期29卷 1962-1966页

作者：律凤霞潘永明郭兆奎牡丹江师范学院生物系黑龙江牡丹江157012 黑龙江省烟草科技研究所黑龙江牡丹江157011

依据RNA干涉机制,以TMV复制酶基因为靶标基因,针对TMV5个株系复制酶基因间高度同源序列设计引物,经RT-PCR反应获得靶序列,构建靶序列反向重复结构的RNA干涉双元载体。用根癌农杆菌介导将外源基因转化至烟草品种K326基因组中,培育RNA干... 详细信息

依据RNA干涉机制,以TMV复制酶基因为靶标基因,针对TMV5个株系复制酶基因间高度同源序列设计引物,经RT-PCR反应获得靶序列,构建靶序列反向重复结构的RNA干涉双元载体。用根癌农杆菌介导将外源基因转化至烟草品种K326基因组中,培育RNA干涉转基因烟草。人工接种病毒验证转基因烟草中外源基因在植物抗病毒能力方面的表达效果,实时荧光定量PCR分析转基因烟草抗病毒能力。结果表明,实验培育的RNA干涉转基因烟草67%对TMV呈现高度抗性;荧光定量PCR分析显示,对TMV具高度抗性的转基因烟草中病毒复制酶基因转录产物mRNA存在很大程度的降解,证实了RNA干涉技术在培育抗病毒烟草品种中的效果。

关键词： RNA干涉烟草花叶病毒载体构建基因表达