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耦合透性化辅酶循环制备手性(R)-苯基乙醇

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精细化工 2016年第11期33卷 1219-1226页

作者：彭益强陈李玲华侨大学工业生物技术福建省高等学校重点实验室福建厦门361021

通过耦合透性化博伊丁假丝酵母(Candida boidinii,C.boidinii)加强了近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis,C.parapsilosis)内羰基还原酶(Carbonyl reductase,CR)催化反应中的辅酶循环与反复利用,构建了有效的手性(R)-苯基乙醇透性化细胞耦合制备体系。实验结果如下:透性化的C.parapsilosis细胞底产物渗透效果增强,底物转化率由33.5%提升到43.8%;进一步外添加辅酶后,底物转化率由43.8%提高到了52.1%;耦合透性化C.boidinii细胞并同时外添加辅酶可大大增强辅酶循环效率,底物转化率可提高至71.8%。优化透性化细胞耦合体系反应条件,当以0.2 g近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)为基准时,在C.parapsilosis与C.boidinii细胞质量比为1.5∶1,底物浓度为10 mmol/L,辅酶浓度为0.1 mmol/L时,底物转化率可达78.2%。离心法收集细胞进行多批次反应,当反应12批次时,耦合体系仍然保持有55%底物转化率,此时总的底物转化率达70.3%,产物经高效液相色谱测定为(R)-苯基乙醇,对映体过量值(e.e.值)达98.2%。

关键词：透性化细胞辅酶再生羰基还原酶甲酸脱氢酶 (R)-苯基乙醇生物工程

纳米粒子固定化双酶耦合体系连续催化制备(R)-苯基乙二醇

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过程工程学报 2016年第2期16卷 286-291页

作者：彭益强张尧华侨大学工业生物技术福建省高等学校重点实验室福建厦门361021

将活化醇盐水解法制备的SiO2纳米粒子分别与羰基还原酶（CR）和甲酸脱氢酶（FDH）进行共价固定化,固定化CR与FDH耦合,连续催化转化b-羟基苯乙酮制备（R）-苯基乙二醇,考察了NADH的再生与循环利用性.结果表明,纳米粒子固定化CR和FDH酶载... 详细信息

将活化醇盐水解法制备的SiO2纳米粒子分别与羰基还原酶（CR）和甲酸脱氢酶（FDH）进行共价固定化,固定化CR与FDH耦合,连续催化转化b-羟基苯乙酮制备（R）-苯基乙二醇,考察了NADH的再生与循环利用性.结果表明,纳米粒子固定化CR和FDH酶载量分别为3.32和5.55 mg/g,催化活性为游离酶的50%～60%,最适反应p H值分别为6.5和8.5,最适反应温度分别为40和45℃.耦合体系进行12批次反应,产物（R）-苯基乙二醇累积量达35.6 g/L,纳米粒子生产能力达178 g/g.纳米粒子固定化酶经简单离心收集后可重复利用.

关键词： SiO2纳米粒子固定化酶羰基还原酶甲酸脱氢酶 (R)-苯基乙二醇再生

添加物对聚电解质成膜特性的影响及相关机理探讨

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物理化学学报 2007年第9期23卷 1415-1420页

作者：陈国姚善泾方柏山彭益强华侨大学工业生物技术福建省高等学校重点实验室福建泉州362021 浙江大学化学工程与生物工程学系杭州310027

研究了添加不同分子量、不同带电特性的物质(如葡萄糖、PEG聚合物系列、NaCl和CMC)到成囊溶液中,考察它们对制得的NaCS/PDMDAAC胶囊性质的影响.同时,测定了聚电解质稀溶液的粘度、电导、zeta电位及聚合物阴阳离子反应后的悬浊液的浊度及... 详细信息

研究了添加不同分子量、不同带电特性的物质(如葡萄糖、PEG聚合物系列、NaCl和CMC)到成囊溶液中,考察它们对制得的NaCS/PDMDAAC胶囊性质的影响.同时,测定了聚电解质稀溶液的粘度、电导、zeta电位及聚合物阴阳离子反应后的悬浊液的浊度及zeta电位.结果表明,通过添加物对稀电解质溶液性质的影响可判断其对胶囊特性的影响.分析了添加物对NaCS与PDMDAAC反应的影响,并根据溶液格子理论对胶囊的宏观特性变化提出了一个可能的微观解释.

关键词：聚电解质 PEC膜微胶囊 zeta电位比浓粘度

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膜反应器中辅酶再生体系的构建与研究进展

化工进展 2006年第3期25卷 264-270页

作者：彭益强方柏山华侨大学工业生物技术研究所泉州362021

在膜反应器中基于膜介质支持构建辅酶再生的酶催化体系并实现酶促反应的连续进行是辅酶依赖型生物酶工业化应用的一个有效技术手段。本文总结了辅酶再生的意义与辅酶再生体系在膜反应器中的构建情况,并提出了在这过程中所需注意的问题... 详细信息

在膜反应器中基于膜介质支持构建辅酶再生的酶催化体系并实现酶促反应的连续进行是辅酶依赖型生物酶工业化应用的一个有效技术手段。本文总结了辅酶再生的意义与辅酶再生体系在膜反应器中的构建情况,并提出了在这过程中所需注意的问题及解决思路。

关键词：辅酶再生膜反应器酶法电化学法

源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶的分离纯化与反应机制

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化工进展 2009年第10期28卷 1808-1813,1827页

作者：彭益强方柏山工业生物技术高等学校重点实验室华侨大学福建厦门361021

使用两步发酵法培养博伊丁假丝酵母(Candida boidinii),菌株细胞经破碎与分离所得粗酶液经DEAE SepHaroses Fast Flow层析快速纯化获得NAD+依赖型的甲酸脱氢酶,酶的比活从0.83U/mg提高到2.67U/mg,纯化倍数和回收率分别为3.22倍和29.7%... 详细信息

使用两步发酵法培养博伊丁假丝酵母(Candida boidinii),菌株细胞经破碎与分离所得粗酶液经DEAE SepHaroses Fast Flow层析快速纯化获得NAD+依赖型的甲酸脱氢酶,酶的比活从0.83U/mg提高到2.67U/mg,纯化倍数和回收率分别为3.22倍和29.7%。研究了从反应物消耗到产物生成之间的酶反应历程,确定了甲酸脱氢酶的酶促反应为有序BiBi反应机制,其中NAD+是第一底物,HCOONa是第二底物,NADH是首先释放的第一产物,HCO3ˉ是随后释放的第二产物;二次作图法求解出Vmax、KiS1、KmS2、KmS1等动力学参数,确定甲酸脱氢酶有序BiBi反应速度方程为r=(2.3*10-4[S1][S2])/(1.123*10-2[S1]+1.91*10-6+[S1][S2])。

关键词：甲酸脱氢酶反应动力学辅酶再生

源于马铃薯的多酚氧化酶活性中心必需基团组成与抑制机理

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化工进展 2012年第2期31卷 406-411页

作者：彭益强刘鹏邓峰刘宇华侨大学工业生物技术福建省高等学校重点实验福建厦门361021

探讨源于马铃薯多酚氧化酶(PPO)的酶活性中心必需基团组成与抑制剂对PPO的抑制作用类型。应用具有相对专一性的氨基酸基团化学修饰剂溴乙酸(BrAC)、乙酰丙酮(Hacac)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、1,4-二硫代苏糖醇(DTT)与对氯汞苯甲酸(pCMB... 详细信息

探讨源于马铃薯多酚氧化酶(PPO)的酶活性中心必需基团组成与抑制剂对PPO的抑制作用类型。应用具有相对专一性的氨基酸基团化学修饰剂溴乙酸(BrAC)、乙酰丙酮(Hacac)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、1,4-二硫代苏糖醇(DTT)与对氯汞苯甲酸(pCMB)等对PPO进行化学修饰反应,确定源于马铃薯的多酚氧化酶活性中心必需基团组成为组氨酸(His)的咪唑基、精氨酸(Arg)的胍基与色氨酸(Trp)残基,二硫键对酶活性中心的稳定有贡献作用但游离的硫基不是酶反应所必需的基团。抑制动力学实验表明乙醇对PPO的半抑制浓度(IC50)为0.12 mmol/L,抑制类型为竞争性可逆抑制,苯甲酸对PPO的IC50为0.07 mmol/L,抑制类型为非竞争性可逆抑制。说明乙醇通过与PPO酶活中心结合抑制PPO酶活性而苯甲酸则通过与PPO非酶活中心的结合抑制PPO酶活。

关键词：多酚氧化酶酶活性中心必需基团可逆抑制马铃薯

源于红豆的羰基还原酶在(R)-苯基乙二醇制备中的应用

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过程工程学报 2016年第3期16卷 488-493页

作者：彭益强鞠翰雪华侨大学工业生物技术福建省高等学校重点实验室福建厦门361021

采取研磨、离心分离、多层过滤和丙酮沉析等步骤,从红豆中提取具有不对称还原芳香酮能力的羰基还原酶(CR),经快速分离纯化获得了纯化倍数为5.8倍的红豆源CRrb酶液,考察了其酶学特性,与微生物源CR的酶学特性进行比较,将CRrb与甲酸脱氢酶(... 详细信息

采取研磨、离心分离、多层过滤和丙酮沉析等步骤,从红豆中提取具有不对称还原芳香酮能力的羰基还原酶(CR),经快速分离纯化获得了纯化倍数为5.8倍的红豆源CRrb酶液,考察了其酶学特性,与微生物源CR的酶学特性进行比较,将CRrb与甲酸脱氢酶(FDH)耦合构建CRrb/FDH双酶体系连续催化β-羟基苯乙酮制备(R)-苯基乙二醇.结果表明,源于红豆的CRrb最适反应pH值为6.0,最适反应温度为45℃,在40～60℃范围内耐热性好于一般微生物源CR.CRrb的米氏常数Km=5.68 mmol/L,最大反应速率Vmax=20.21μmol/(min·m L),对底物的亲和力和催化效率比微生物源CR好.底物较佳耐受浓度为60 mmol/L,较微生物源的CR高.CRrb/FDH酶活比为1:1.5时耦合体系反应效率最佳,批次反应转化1 mol辅酶可获得产物的量由266 mol提高到365 mol.

关键词：红豆羰基还原酶甲酸脱氢酶辅酶再生 (R)-苯基乙二醇

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植酸酶高产菌株的诱变选育和融合筛选

植酸酶高产菌株的诱变选育和融合筛选

作者：彭益强华侨大学

学位级别：硕士

本文以多轮紫外诱变为主线技术筛选植酸酶的黑曲霉高产菌，分析比较植酸酶酶活定义和植酸酶酶活测定方法并修正其测量波长，考查黑曲霉原生质体制备的影响因素，并在此基础上，用原生质体紫外复合诱变和原生质体融合技术筛选植酸酶的黑... 详细信息

本文以多轮紫外诱变为主线技术筛选植酸酶的黑曲霉高产菌，分析比较植酸酶酶活定义和植酸酶酶活测定方法并修正其测量波长，考查黑曲霉原生质体制备的影响因素，并在此基础上，用原生质体紫外复合诱变和原生质体融合技术筛选植酸酶的黑曲霉产生菌。首先用粗略制备的原生质体经紫外诱变筛选到一株酶活为2250u／ml的实验出发菌;制备成菌悬液，紫外灯下照射诱变，红光下涂抹筛选平板，恒温培养2～3d;按透明圈大小进行预初筛，挑选径圈比大的菌落接斜面，恒温培养3d;按一株一瓶的方式进行初筛;从中选取酶活较大的3～5株，按一株2～3瓶的方式进行复筛;挑取酶活大且稳定的1～2株进入下一代诱变筛选。经过5代如此反复诱变选育，筛选到一株酶活稳定在12200～12800u／ml的黑曲霉菌株Asp-5-12，酶活力提高了5.7倍。分析比较了目前文献上所见到的四种植酸酶酶活定义和四种植酸酶酶活测定方法，并修正了测量波长。确定本实验用的植酸酶酶活定义为：55℃，pH4.6的条件下，每分钟从0.1％的植酸钠溶液中释放1nmol的无机磷为一个酶活单位(u)。确定本实验用的植酸酶酶活测定方法为丙酮法，测量波长修正为420nm。影响黑曲霉菌株制备原生质体的因素主要有：菌丝体菌龄、酶浓度、酶组成、酶解温度、酶解时间、稳定剂和离子Ca等。分别采用单因子法和正交实验法考查，认为16～18hr菌龄的菌丝体，32℃,用含0.2％Ca的PBA高渗缓冲液配制的1％纤维素酶与1％蜗牛酶的混合酶酶解3hr，得到的原生质体数最多。平板再生时用蔗糖高渗液稀释涂抹，有利再生。采用原生质体紫外复合诱变技术加大诱变力度。从中筛选出一株可能更适合于作动物饲料添加剂的植酸酶产生菌，与一般报道不同的是，它的第一酶活峰在pH2.6处，正好适于在单胃动物的胃酸环境(pH1.5～3.5)内作用。本文还初步进行了用原生质体融合技术筛选高产植酸酶的黑曲霉菌株的实验研究。采用灭活原生质体融合技术，既简化了实验，又实现了遗传物质单向传递。实验结果，原生质体融合率为0.403％，可深入研究提高融合率的条件。

关键词：黑曲霉植酸酶紫外诱变原生质体融合

甲壳素脱乙酰酶作用机理及基因表达的研究进展

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中国医药工业杂志 2005年第11期36卷 716-719页

作者：彭益强方柏山华侨大学工业生物技术研究所福建泉州362021

综述了甲壳素脱乙酰酶(CDA)催化甲壳素脱乙酰基的多点进攻作用机理、酶法制备壳聚糖的特性以及克隆表达CDA基因的研究进展。

关键词：甲壳素脱乙酰酶甲壳素壳聚糖综述