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超表达HnCYP82M3和DsTRI基因对颠茄托品烷生物碱合成的影响

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药学学报 2024年第3期59卷 775-783页

作者：穆德会刘艳红陈漂漂谭艾娟马炳南潘航张明生强玮贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室贵州贵阳550025

托品烷生物碱(TAs)是一类临床上广泛应用的抗胆碱药物,颠茄是提取TAs的主要药源植物,利用代谢工程技术大量获取TAs具有重要的产业价值。本研究基于开源引流代谢工程策略,在颠茄发根中超表达TAs合成途径分支处的细胞色素氧化酶(cytochrom... 详细信息

托品烷生物碱(TAs)是一类临床上广泛应用的抗胆碱药物,颠茄是提取TAs的主要药源植物,利用代谢工程技术大量获取TAs具有重要的产业价值。本研究基于开源引流代谢工程策略,在颠茄发根中超表达TAs合成途径分支处的细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase,CYP82M3)HnCYP82M3(来源于天仙子)和托品酮还原酶I(tropinone reductase I,TRI)DsTRI(来源于曼陀罗)两个酶基因,以期通过CYP82M3催化合成托品酮(开源),TRI进而将托品酮引入TAs合成的代谢方向(引流),大量促进3种TAs的积累。从天仙子根中克隆了HnCYP82M3基因,其编码氨基酸与颠茄AbCYP82M3序列一致性高达91.7%。单独超表达HnCYP82M3不影响颠茄发根TAs的含量,说明CYP82M3不是TAs合成的关键酶。同时超表达HnCYP82M3和DsTRI极大促进了3种TAs的积累,莨菪碱、山莨菪和东莨菪碱含量分别是对照的4.97倍、2.83倍和2.19倍,并且提高幅度大于DsTRI单表达。本研究证明分支点处酶基因共表达的开源引流策略是有效提高颠茄TAs合成的代谢工程新方法,为工业化大量获取TAs奠定了理论和技术基础。

关键词： CYP82M3 TRI 托品烷生物碱颠茄代谢工程

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青岛西海岸珊瑚贝桥创意构思与总体设计

城市道桥与防洪 2024年第1期 116-119,M0011页

作者：俞雷李永君强玮怡上海市政工程设计研究总院(集团)有限公司上海市200092

青岛西海岸珊瑚贝桥连接西海岸滨海大道和名人岛(人工岛),功能定位为青岛滨海标志性景观桥梁,桥梁全长290 m,主桥为40 m+70m+70 m+40 m钢结构连续箱梁,梁上设置钢结构空间曲面异形拱,引桥为35 m+35 m钢结构连续箱梁。结合青岛城市文化... 详细信息

青岛西海岸珊瑚贝桥连接西海岸滨海大道和名人岛(人工岛),功能定位为青岛滨海标志性景观桥梁,桥梁全长290 m,主桥为40 m+70m+70 m+40 m钢结构连续箱梁,梁上设置钢结构空间曲面异形拱,引桥为35 m+35 m钢结构连续箱梁。结合青岛城市文化和桥位环境,通过新颖的创意构思和创新的设计方法,将结构设计和景观设计融为一体,珊瑚贝桥的建成效果达到预期,成为青岛乃至全国的标志性景观桥和网红桥。重点介绍该桥的创意构思理念、总体设计以及钢结构施工情况。

关键词：景观桥梁总体设计创意构思珊瑚贝桥 BIM正向设计钢结构加工

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钩藤STR基因及其启动子的克隆与分析

药学学报 2022年第5期57卷 1526-1536页

作者：周浩路星星敖雯雯廖海民张明生强玮贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室山地生态与农业生物工程协同创新中心贵州贵阳550025

根据钩藤转录组中STR基因核心序列设计特异性引物,并进行RACE扩增,克隆到UrSTR基因(GeneBank:OL310251)的cDNA全长1541 bp,编码345个氨基酸;采用染色体步移克隆到UrSTR基因启动子(GeneBank:OL310252)序列1179 bp。系统进化发育树分析显... 详细信息

根据钩藤转录组中STR基因核心序列设计特异性引物,并进行RACE扩增,克隆到UrSTR基因(GeneBank:OL310251)的cDNA全长1541 bp,编码345个氨基酸;采用染色体步移克隆到UrSTR基因启动子(GeneBank:OL310252)序列1179 bp。系统进化发育树分析显示,钩藤UrSTR蛋白与同为茜草科的美丽帽柱木和短小蛇根草的STR蛋白聚为一类,其亲缘关系最近;亚细胞共定位实验表明UrSTR蛋白定位于液泡膜上;SDS-PAGE结果表明pET-28a-UrSTR重组蛋白成功表达且大小与预期相符;启动子顺式作用元件分析表明其含有光响应、胁迫响应和激素响应有关的多种调控元件;启动子活性分析UrSTR基因启动子具有转录活性。成功克隆了UrSTR基因及其启动子序列并对其进行生物信息学分析和启动子活性分析;后期需要优化UrSTR原核表达体系,为进一步纯化UrSTR蛋白研究其结构和功能奠定基础。

关键词：钩藤异胡豆苷合成酶启动子亚细胞定位原核表达

颠茄TRI基因的克隆、功能验证及超量表达对颠茄托品烷生物碱合成的影响

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颠茄TRI基因的克隆、功能验证及超量表达对颠茄托品烷生物碱合成...

作者：强玮西南大学

学位级别：硕士

托品烷类生物碱(Tropane alkaloids, TAs)是一类主要提取自茄科植物的小分子含氮化合物,它提供了临床上常用的抗胆碱药物莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine),广泛用于用于镇痛、麻醉、抗晕动药、治疗帕金森症、改善微循环、戒... 详细信息

托品烷类生物碱(Tropane alkaloids, TAs)是一类主要提取自茄科植物的小分子含氮化合物,它提供了临床上常用的抗胆碱药物莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine),广泛用于用于镇痛、麻醉、抗晕动药、治疗帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、治疗农药中毒等,市场需求十分巨大。由于工业合成成本太过昂贵,目前莨菪碱和东莨菪碱主要从茄科植物的颠茄(Atropa belladonna)、莨菪(Hyoscyamus niger)和曼陀罗(Datura stramonium)中提取,产量有限,其中颠茄是中国药典规定的唯一TAs药源植物(国家药典委员会2011版),开展代谢工程以提高颠茄中TAs含量具有十分重要的意义。本研究采用RACE方法克隆了药用植物颠茄的托品酮还原酶(?)(tropinone reductase I, TRI)基因cDNA全长并进行了详细的生物信息学分析,同时构建了该基因的植物组织表达谱和诱导表达谱;原核表达验证酶活后,构建植物表达载体遗传转化颠茄获得转基因发根,经过液体发酵培养至指数生长末期,检测总托品烷生物碱含量和相应的AbTRI基因表达量。最终结果表明：颠茄中AbTR1作为一个控制点酶,它的过量表达能够极大的促进代谢流向莨菪碱和东莨菪碱方向流动,从而显著地提高总托品烷生物碱的产量。 TRI催化托品酮分子上羰基的还原生成α-托品醇(托品),是托品烷生物碱合成途径中间分支处的控制点酶。在莨菪中，TRI基因特异性的仅在根的内皮层和外皮层中强烈表达,曼陀罗和三分三(Anisodus acutangulus)的TRI基因也是克隆至培养的根组织。本研究即以颠茄根为材料,采用RACE技术,基于同源性克隆的方法获得了AbTRI基因全长cDNA,为1079bp,包含一段长度为819bp的CDS、14bp的5’UTR和234bp的3’UTR;polyA长度为13bp,终止密码子为TAA;其编码区编码一段272个氨基酸残基的蛋白序列(AbTRI),预测其分子量大小为29.3KDa,等电点为6.05。对推断的AbTRI基因编码氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明,AbTRI与已报道的茄科其它物种的托品酮还原酶氨基酸序列相似性均在80%以上,而且整体上都很保守,说明它们的TRIs从共同的祖先蛋白开始分化发生在相对较近的时间里;来源于茄科植物、十字花科植物、单子叶植物、细菌的TRIs在发育进化树上明显聚为4支,其中AbTRI与同科不同属的植物三分三TRI的亲缘关系最近,其次是莨菪;保守结构域预测发现AbTRI的氨基酸序列中存在典型的短链脱氢酶(short-chain dehydrogenase/reductase, SDR)特征性结构域,这与曼陀罗和莨若的TRIs已经被鉴定属于SDR家族这一事实相吻合;进一步的三级结构预测发现,在AbTRI的N端SDR所需要的NADPH结合区域,存在SDR优先结合NADPH的保守氨基酸残基Lys31和Arg53,同时在C端底物托品酮结合区域也发现了两个决定托品酮分子以正确的取向结合在TRI酶蛋白上的保守氨基酸残基His112和Va1168。组织表达谱和诱导表达谱分析表明,该基因强烈地在颠茄成熟叶中表达,花苞和须根也有少量表达,其它部位表达微弱,其表达水平强烈地受ABA、ASA、MeJA、UV-B的诱导和SA的抑制,溶剂乙醇也能起到强烈的诱导效果。以pET28/大肠杆菌Rosetta为诱导表达系统对AbTRI基因进行原核表达功能验证,经1mM IPTG诱导培养4h, AbTRI重组蛋白含量达到了细胞总蛋白的50%以上,主要以包含体形式存在,其分子量约为30Kda,与预测的相符。对AbTRI重组蛋白包涵体进行纯化并透析复性后,以托品酮为反应底物,在NADPH存在下,检测RcTYDC重组蛋白的催化活性,利用HPLC法检测到了反应产物托品的生成,表明本研究克隆获得了颠茄的功能AbTRI基因。构建携带AbTRI基因的植物高效表达载体p1304+-AbTRI转化“卸甲”的根癌农杆菌C58C1获得工程菌C58Cl-p1304+-AbTR],遗传转化颠茄叶片,经检测rolB、rolC、Hygr和AbTRI基因后成功筛选出7个转基因发根系,分别进行液体培养基扩大培养然后检测托品烷生物碱(TAs)含量和基因表达量。在检测的7个转基因发根系中,有4个发根系的总TAs含量得到了大幅度的提高,依次为T9>T16>T23>T11,19的总TAs含量比空菌发根对照和空载发根对照分别提高了3.2倍和8.3倍,莨菪碱的提高幅度平均要高于东莨菪碱;另外3个发根系出现了不同程度的基因沉默,TAs含量显著低于对照。利用实时荧光定量PCR技术检测这七个发根系中相应的AbTRI基因表达量,结果与生物碱含量检测的结果基本一致：四个生物碱含量提高的发根系(T9、T16、T23、T11)的基因表达水平都显著高

关键词：颠茄托品烷类生物碱托品酮还原酶-Ⅰ 茛菪碱东莨菪碱

综合护理干预对腹股沟疝手术患儿依从性及术后并发症的影响

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中华疝和腹壁外科杂志（电子版） 2022年第4期16卷 483-486页

作者：强玮徐礼月王广媛宣城市中心医院普通外科安徽省242000

目的探讨综合护理干预对腹股沟疝手术患儿治疗依从性及术后并发症发生率的影响。方法选择2017年1月至2021年12月于宣城市中心医院手术治疗的96例疝患儿的临床资料,随机分为常规组和综合组,每组48例。常规组患儿采用常规围手术期护理模... 详细信息

目的探讨综合护理干预对腹股沟疝手术患儿治疗依从性及术后并发症发生率的影响。方法选择2017年1月至2021年12月于宣城市中心医院手术治疗的96例疝患儿的临床资料,随机分为常规组和综合组,每组48例。常规组患儿采用常规围手术期护理模式干预,综合组患儿采用综合护理模式干预。对比2组患儿的心理状态水平、治疗依从性情况、术后并发症情况以及家长满意度情况。结果2组患儿护理后的汉密尔顿焦虑自评量表、儿童抑郁量表水平均有所下降,且综合组低于常规组(P<0.05);综合组患儿的治疗依从率显著优于常规组(P<0.05);综合组患儿的术后并发症发生率显著低于常规组(P<0.05);综合组的家长满意度显著优于常规组(P<0.05)。结论综合护理干预可有效提高疝手术患儿的治疗依从性,改善患儿内心的负面情绪,提高患儿家长对治疗以及护理服务的满意度。

关键词：疝,腹股沟儿童综合护理依从性并发症

rolB基因对颠茄表型发育和托品烷生物碱合成的影响

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药学学报 2023年第6期58卷 1705-1712页

作者：敖雯雯谭艾娟马炳南穆德会路星星潘航张明生强玮贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室贵州贵阳550025

发根农杆菌pRiA4质粒上的rol基因是促进次生代谢的强效基因,可利用rol基因对颠茄进行分子育种以提升颠茄中托品烷生物碱(tropane alkaloids, TAs)含量。本研究将rolB基因在颠茄植株中进行超表达,为了研究rolB基因对颠茄TAs生物合成的影... 详细信息

发根农杆菌pRiA4质粒上的rol基因是促进次生代谢的强效基因,可利用rol基因对颠茄进行分子育种以提升颠茄中托品烷生物碱(tropane alkaloids, TAs)含量。本研究将rolB基因在颠茄植株中进行超表达,为了研究rolB基因对颠茄TAs生物合成的影响,分析了转基因颠茄的表型、TAs含量及TAs合成途径中关键酶基因的表达水平。结果表明,转基因颠茄根系发达,叶片增大、叶片鲜重增加、叶片颜色加深,花朵增大、花形改变,雌蕊高度降低,花粉活力下降。转基因颠茄茎中TAs的含量显著高于对照,东莨菪碱、山莨菪碱、莨菪碱的含量分别为对照的2.11~2.91、1.23~2.37、4.88~5.20倍。与对照组相比, TAs合成途径中的关键酶基因N-甲基腐胺转移酶(PMT)、吡咯烷聚酮合酶(PYKS)、托品酮还原酶I (TRI)、芳香族氨基酸氨基转移酶4 (ArAT4)、UDP-糖基转移酶1 (UGT1)和莨菪碱6-β-羟化酶(H6H)的表达上调,且托品酮还原酶II (TRII)作为代谢分流基因表达下调。研究表明rolB基因通过增强TAs合成途径代谢流和减弱竞争支路代谢分流,增强了颠茄根中TAs的合成能力和茎中的积累。本研究为利用rolB基因进行高产TAs颠茄的分子育种奠定了基础。

关键词： rolB基因颠茄东莨菪碱山莨菪碱莨菪碱

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茉莉酸甲酯对钩藤生物碱合成的影响

分子植物育种 2023年第10期21卷 3290-3296页

作者：路星星强玮付维敖雯雯周浩谭艾娟张明生贵州大学生命科学学院农业生物工程研究院山地生态与农业生物工程协同创新中心山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室贵阳550025

钩藤中钩藤碱和异钩藤碱是防治心血管疾病的有效活性成分,研究茉莉酸甲酯(MeJA)对钩藤生物碱合成的影响对高效获取这两种生物碱有重要意义。本研究用不同浓度的MeJA(0,100,200,500,1000μmol/L)喷施处理2月龄的钩藤,并检测其生物量、叶... 详细信息

钩藤中钩藤碱和异钩藤碱是防治心血管疾病的有效活性成分,研究茉莉酸甲酯(MeJA)对钩藤生物碱合成的影响对高效获取这两种生物碱有重要意义。本研究用不同浓度的MeJA(0,100,200,500,1000μmol/L)喷施处理2月龄的钩藤,并检测其生物量、叶绿素含量、生物碱含量和合成途径基因表达量。结果显示,钩藤叶绿素含量随MeJA浓度和处理时间的增加而逐渐降低;200μmol/L的MeJA最适于钩藤的生长和生物碱积累,该浓度处理钩藤的鲜重和干重最高;处理后第6天,钩藤碱(439.772μg/g)和异钩藤碱(1134.223μg/g)含量达到最高,分别是对照的1.412和1.548倍;STR、TDC和SGD基因表达量受MeJA诱导,分别在4、6和8 h达到对照的1.941、4.001和27.436倍。Me JA虽会抑制钩藤叶绿素合成,但适宜浓度的MeJA处理能有效促进钩藤植株生长和钩藤生物碱的合成,为进一步研究钩藤中生物碱生物合成的分子调控机制提供了理论依据。

关键词：钩藤钩藤碱异钩藤碱茉莉酸甲酯

单周期CRM PFC转换器的零交越失真优化设计

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西安电子科技大学学报 2012年第2期39卷 108-113页

作者：李娅妮杨银堂朱樟明强玮刘帘曦西安电子科技大学宽禁带半导体材料与器件教育部重点实验室陕西西安710071 西安龙腾微电子技术发展有限公司陕西西安710065

为降低总谐波失真提高电源效率,基于单周期临界导通功率因数校正(PFC)转换器,研究了零交越失真现象的优化设计方法.采用周期性自启动定时电路,不论电感电流是否下降到零,及时触发新的开关周期,以避免由于电感反向漏电所引入的导通延迟,... 详细信息

为降低总谐波失真提高电源效率,基于单周期临界导通功率因数校正(PFC)转换器,研究了零交越失真现象的优化设计方法.采用周期性自启动定时电路,不论电感电流是否下降到零,及时触发新的开关周期,以避免由于电感反向漏电所引入的导通延迟,从而降低了零交越失真和总谐波失真;在辅助绕组和振荡器之间引入可调分流电阻,对电感电流进行实时监控,调整振荡器输出波形斜率,以控制PWM关断时间,有效改善输入电压零交越点附近的失真现象.输入线电压频率越高,优化效果越好.在50Hz 220 VAC条件下,输入电流为120mA,输出功率为36W,测得优化后的PFC转换器总谐波失真(THD)仅为3.8%,功率因数为0.988,负载调整率为3%,线性调整率小于1%,效率达到97.3%.理论和测试结果均表明:当交流输入线电压接近零值时,优化后系统的零交越失真及THD得到了有效降低,有效芯片面积为1.61mm×1.52mm.

关键词：功率因数校正零交越失真单周期临界模式总谐波失真

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rolC基因对颠茄托品烷生物碱合成的影响

药学学报 2022年第2期57卷 533-540页

作者：路星星谭艾娟周浩敖雯雯吕世明满建民张明生强玮贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室山地生态与农业生物工程协同创新中心贵州贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

发根农杆菌浸染植物后产生的发根可合成高水平次生代谢产物,这种代谢增强作用是由rol基因诱导激发的,因此可利用rol基因提高颠茄中托品烷生物碱(tropane alkaloids,TAs)的合成能力。本研究以颠茄为实验材料,将发根农杆菌pRiA4质粒上的r... 详细信息

发根农杆菌浸染植物后产生的发根可合成高水平次生代谢产物,这种代谢增强作用是由rol基因诱导激发的,因此可利用rol基因提高颠茄中托品烷生物碱(tropane alkaloids,TAs)的合成能力。本研究以颠茄为实验材料,将发根农杆菌pRiA4质粒上的rolC基因通过CaMV35S启动子驱动,导入颠茄中超表达。分析转基因颠茄的表型、TAs含量以及TAs合成途径关键酶基因转录表达水平表化。结果表明,转基因颠茄表现出根系发达、雄性不育、雄蕊柱长高于雌蕊、提前开花、节间缩短、花小且多、腋芽和侧芽增多、顶端优势下降和叶片狭长等表型;转基因颠茄的TAs含量均显著高于对照,莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量最高可达对照的2.58、3.59和15.77倍;TAs合成途径中的3个关键酶基因腐胺N-甲基转移酶(PMT)、托品酮还原酶I(TRⅠ)和莨菪碱6-β-羟化酶(H6H)的表达量与对照相比表达上调。以上研究表明rolC基因通过上调颠茄TAs合成关键酶基因的表达提高了颠茄中TAs的合成能力,为利用rolC基因进行高TAs含量的颠茄分子育种奠定了基础。

关键词：颠茄 rolC基因莨菪碱东莨菪碱山莨菪碱