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猪卵巢颗粒细胞中circINHBA的鉴定及与细胞凋亡的相关性分析

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畜牧与兽医 2024年第10期56卷 14-20页

作者：王彩霞秦鑫鑫李文洁程晓龙张瑀格张金璧潘增祥南京农业大学动物科技学院江苏南京210095

实验室前期通过RNA测序发现1个新的环状RNA分子circINHBA,并确定其在猪健康和早期闭锁卵泡中呈现显著差异表达。本研究旨在鉴定并分析circINHBA的表达模式,探索其在猪卵泡颗粒细胞(GCs)凋亡中的作用,为揭示调控猪卵泡闭锁的机制、筛选... 详细信息

实验室前期通过RNA测序发现1个新的环状RNA分子circINHBA,并确定其在猪健康和早期闭锁卵泡中呈现显著差异表达。本研究旨在鉴定并分析circINHBA的表达模式,探索其在猪卵泡颗粒细胞(GCs)凋亡中的作用,为揭示调控猪卵泡闭锁的机制、筛选调控猪卵泡闭锁和GCs凋亡的靶标调节物提供依据。根据circINHBA,设计跨反向剪切位点的发散引物,通过PCR、琼脂糖凝胶电泳、Sanger测序鉴定circINHBA的环状结构,并通过使用或不使用Rnase R消化的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进行稳定性检验;利用核质分离技术和荧光原位杂交技术(FISH)分析猪卵泡GCs中circINHBA的亚细胞定位;RT-qPCR检测circINHBA在猪健康和早期闭锁卵泡中的表达情况,通过circINHBA干扰试验分析其对凋亡标志基因BCL2和BAX表达的影响;利用流式细胞术分析circINHBA对猪卵泡GCs凋亡的影响。结果:成功验证circINHBA为一种新的环状RNA分子,具有稳定的环状结构;定量分析发现,circINHBA在健康卵泡中的表达量显著高于早期闭锁卵泡,且亚细胞定位结果表明其主要分布于细胞质;特异性si-RNA干扰试验及凋亡标志基因检测发现circINHBA具有抑制猪卵泡GCs凋亡的作用。综上,本研究证实了1个全新circINHBA分子对猪卵泡GCs凋亡的影响,揭示了其在猪卵泡闭锁过程中的潜在作用,为进一步探究环状RNA分子在猪卵泡闭锁过程中的调控作用及分子机制奠定了基础。

关键词：环状RNA circINHBA 猪卵泡闭锁颗粒细胞凋亡

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FSH处理对猪颗粒细胞中类固醇合成酶基因的表达及其调控区组蛋白H3修饰的影响

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中国农业科学 2018年第18期51卷 3582-3590页

作者：张金璧姚望潘增祥刘红林南京农业大学动物科技学院

【目的】研究FSH处理对猪卵巢颗粒细胞类固醇合成酶、垂体激素受体、凋亡相关等基因表达的影响及此过程中组蛋白H3修饰的变化情况。【方法】首先,采集猪卵巢组织并用注射器抽取方法收集卵泡颗粒细胞,用含血清体系体外培养颗粒细胞至贴壁... 详细信息

【目的】研究FSH处理对猪卵巢颗粒细胞类固醇合成酶、垂体激素受体、凋亡相关等基因表达的影响及此过程中组蛋白H3修饰的变化情况。【方法】首先,采集猪卵巢组织并用注射器抽取方法收集卵泡颗粒细胞,用含血清体系体外培养颗粒细胞至贴壁,血清饥饿16h后用终浓度5IU·mL的FSH处理24h,并收集细胞。其次,提取细胞m RNA,采用qRT-PCR方法检测类固醇合成酶(STAR、CYP11A1、HSD3B和CYP19A1)、垂体激素受体(FSHR和LHR)、凋亡相关基因(XIAP和Fas L)m RNA的表达变化,最后,相同处理后固定细胞,采用染色质免疫沉淀结合q PCR(Ch IP-q PCR)方法检测类固醇合成酶基因STAR、CYP19A1和HSD3B上游转录调控区组蛋白H3修饰(H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac)状况。【结果】5IU·mL的FSH处理引起类固醇合成酶基因STAR、CYP19A1和HSD3B分别为2倍(P<0.01)、2.8倍(P<0.01)和3.6倍(P<0.05)的显著上调,而CYP11A1表达水平没有显著变化;FSH处理对垂体激素受体FSHR、LHR和凋亡相关基因XIAP、Fas L影响不显著。在上调的三个类固醇合成酶基因中,HSD3B调控区组蛋白H3修饰变化最为显著,H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac结合分别有14.7倍(P<0.01)、13.6倍(P<0.01)、19.7(P<0.01)倍和2.5倍(P<0.05)的显著上调;STAR基因调控区的H3K9ac在处理后有11.1倍的显著下降(P<0.05);CYP19A基因调控区的H3K4me3和H3K9ac分别有0.5倍的上调(P<0.01)和10.4倍(P<0.01)的下降,其余组蛋白修饰在处理前后没有显著变化。【结论】FSH处理24h对颗粒细胞类固醇合成酶基因转录有显著上调作用,对其转录过程有H3组蛋白修饰参与,组蛋白修饰模式具有基因特异性。垂体激素受体和凋亡相关基因的应答可能需要FSH和其他因素的联合作用。

关键词：猪 FSH 颗粒细胞类固醇合成酶组蛋白修饰

类固醇激素合成酶及相关受体表达与猪卵泡闭锁过程的关系研究

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类固醇激素合成酶及相关受体表达与猪卵泡闭锁过程的关系研究

作者：张金璧南京农业大学

学位级别：硕士

卵泡发育过程中伴随着大量卵泡的退化,卵泡在到达排卵之前所发生的退化过程即卵泡闭锁(atresia)。卵泡闭锁是卵泡形成以后生殖细胞退化的主要方式,在所有的脊椎动物中都发现了卵泡闭锁现象,而且绝大多数卵泡都以闭锁的方式消失了。卵泡... 详细信息

卵泡发育过程中伴随着大量卵泡的退化,卵泡在到达排卵之前所发生的退化过程即卵泡闭锁(atresia)。卵泡闭锁是卵泡形成以后生殖细胞退化的主要方式,在所有的脊椎动物中都发现了卵泡闭锁现象,而且绝大多数卵泡都以闭锁的方式消失了。卵泡闭锁是多因素参与的复杂调控过程,动物实验已证实了某些因子的调控作用,但卵泡闭锁的机制仍有待于进一步的研究,其对控制人类生育、提高辅助生殖助孕技术的妊娠率、提高家畜繁殖率、阐明某些与排卵障碍有关疾病的机理都具有重要指导意义。本研究选用3-5mmm直径的猪卵泡,首先通过外观判定,卵泡腔颗粒细胞计数以及卵泡液中孕酮、雌二醇比例的测定三种方法对其闭锁程度进行分类;然后检测了健康和早、晚期闭锁卵泡中一系列类固醇合成酶基因以及相关激素受体基因表达量的变化,分析了这些基因表达量彼此间,及其与卵泡生理指标变化间的相关性,分析了类固醇合成酶系统在有腔卵泡闭锁中的调控作用。研究结果如下：1、建立了判断猪卵泡闭锁程度的统一方法。本研究通过“外观判断+颗粒细胞密度+孕激素/雌激素比例”三个指标综合检测和判定分别处于健康、早期闭锁和晚期闭锁三阶段的卵泡。具体判断标准包括：1)外观标准：健康的卵泡呈清澈粉红色,卵丘卵母细胞复合体清晰可见,颗粒细胞层完整;早期闭锁卵泡呈较浑浊的暗橘黄色,卵丘卵母细胞复合体难以辨认,颗粒细胞层有破皱和部分脱落;晚期闭锁的卵泡呈浅浑浊的灰色,卵丘卵母细胞复合体脱落,颗粒细胞层严重脱落并沉积。2)颗粒细胞密度标准：健康组密度10000个/μL。3)激素比例标准：健康组P4/E2<5;早期闭锁组5

关键词：类固醇合成酶激素受体卵泡闭锁

猪VEGFA 3′UTR生物信息学分析及其与miR-361-5p的靶向验证

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畜牧与兽医 2019年第8期51卷 1-6页

作者：高晓梦张金璧李齐发南京农业大学动物科技学院

为了扩增并分析猪卵泡颗粒细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)基因3编码区(3′UTR)序列、构建VEGFA 3′UTR荧光素酶报告质粒以及利用双荧光素酶报告基因验证miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系,试验通过RT-PCR扩增VEGFA 3′UTR,并用生物... 详细信息

为了扩增并分析猪卵泡颗粒细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)基因3编码区(3′UTR)序列、构建VEGFA 3′UTR荧光素酶报告质粒以及利用双荧光素酶报告基因验证miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系,试验通过RT-PCR扩增VEGFA 3′UTR,并用生物信息学方法分析预测其保守性及潜在的互作miRNA,最后将扩增的VEGFA 3′UTR序列克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-361-5p mimics(试验组)或NC mimics(对照组)共同转染293细胞,通过双荧光素酶报告系统检测两组细胞的荧光素酶活性,从而鉴定miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系。结果表明:在猪卵泡颗粒细胞中成功扩增了VEGFA基因3′UTR序列,其在哺乳动物中保守性较高,有多个潜在miRNA结合位点;成功构建了VEGFA基因3′UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-361-5p可以直接作用于VEGFA基因3′UTR,抑制其荧光素酶活性。

关键词：猪 VEGFA microRNAs miR-361-5p 3′非翻译区双荧光素酶报告载体

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核酸-蛋白质互作的生物化学研究方法

遗传 2009年第3期31卷 325-336页

作者：张金璧潘增祥林飞马雪山刘红林南京农业大学动物科技学院南京210095

研究核酸-蛋白质的互作是揭示生命活动机理的基础,文章简要综述了用于研究核酸-蛋白质互作的各种生物化学方法。从体内、体外两个研究角度,针对核酸、蛋白以及复合物3个研究水平,概述了硝化纤维膜过滤实验、足迹法、EMSA、Southwestern... 详细信息

研究核酸-蛋白质的互作是揭示生命活动机理的基础,文章简要综述了用于研究核酸-蛋白质互作的各种生物化学方法。从体内、体外两个研究角度,针对核酸、蛋白以及复合物3个研究水平,概述了硝化纤维膜过滤实验、足迹法、EMSA、Southwestern杂交等经典分析方法的原理、发展和运用。还着重介绍了最近在表观遗传学领域中广泛运用的nChIP、xChIP等基本染色质免疫沉淀(ChIP)技术及其衍生出的ChIP-on-chip等方法。

关键词：核酸蛋白质互作足迹染色质免疫沉淀

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猪不同程度闭锁卵泡判定方法的比较研究

南京农业大学学报 2013年第1期36卷 115-119页

作者：张金璧林飞潘增祥马雪山李齐发刘红林南京农业大学动物科技学院江苏南京210095

以猪卵泡为试验材料,在总结各种分类方法的同时,通过具体的试验分析了几种可持续跟踪研究的分类方法(外观形态、颗粒细胞密度、孕酮(P4)和雌二醇(E2)的比值)间的关系。经过对239个卵泡的分离和检测,以及对在不同闭锁阶段各20个共60个在... 详细信息

以猪卵泡为试验材料,在总结各种分类方法的同时,通过具体的试验分析了几种可持续跟踪研究的分类方法(外观形态、颗粒细胞密度、孕酮(P4)和雌二醇(E2)的比值)间的关系。经过对239个卵泡的分离和检测,以及对在不同闭锁阶段各20个共60个在各个判定指标上都达到一致的卵泡进行分析和比较,检验各判定指标与猪卵泡闭锁的关系,形成了合理的综合判定标准:在外观判定基础上将颗粒细胞数小于2 500μL-1、2 500～10 000μL-1、大于10 000μL-1分别定义为健康、早期闭锁及晚期闭锁卵泡,而相应的P4/E2值分别为小于5、5～20及大于20。

关键词：猪卵巢卵泡闭锁闭锁程度

猪卵泡闭锁过程中circINHBB的鉴定及其对颗粒细胞凋亡的影响

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中国农业科学 2021年第18期54卷 3998-4007页

作者：马梦楠王慧明王苗苗姚望张金璧潘增祥南京农业大学动物科技学院

【背景】卵泡的发育状况和成熟排卵数量是哺乳动物的繁殖力和生产性能的重要决定因素。卵泡闭锁是卵泡停止发育并发生退化的过程,可能发生在卵泡发育的各个阶段,而闭锁的发生与卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡情况密切相关,而颗粒细胞的凋亡... 详细信息

【背景】卵泡的发育状况和成熟排卵数量是哺乳动物的繁殖力和生产性能的重要决定因素。卵泡闭锁是卵泡停止发育并发生退化的过程,可能发生在卵泡发育的各个阶段,而闭锁的发生与卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡情况密切相关,而颗粒细胞的凋亡过程十分复杂并且受到各种细胞因子的调控作用。环状RNA(circRNA)是近年来在生物体内发现的一种环状结构非编码RNAs(ncRNAs)。研究证明circRNA普遍存在于各个组织且参与到各种生理过程的调节中,但其在家畜繁殖学领域,尤其是猪卵巢和卵泡中的表达变化、位置分布和生物学功能研究较少。抑制素(INH)是一种性腺糖蛋白激素,主要由雌性动物卵巢卵泡的颗粒细胞产生,是控制哺乳动物排卵的重要因子。前期实验发现,猪卵泡中INHβ亚基INHBB编码基因的mRNA的前体可能形成一个circRNA,即circINHBB。【目的】在猪中等有腔卵泡组织中验证circINHBB的序列结构及其在颗粒细胞中的分布情况;分析其在健康、闭锁卵泡中的表达差异;在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中探索了circINHBB对细胞凋亡的调控作用,并对circINHBB可能介导的功能性miRNA做出预测,为家畜繁殖领域的circRNAs研究扩宽思路,为提高家畜繁殖力研究提供参考。【方法】采集中等大小猪卵泡,进行RNA提取及反转录获得猪卵泡的cDNA,利用反向引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经Sanger测序证明circINHBB的序列和环状结构;设计circINHBB的特异性荧光探针,运用FISH实验验证circINHBB在猪卵泡颗粒细胞核、质中的分布情况;然后,通过外观、激素和颗粒细胞密度指标选取健康和闭锁两组,用qRT-PCR检测circINHBB在猪健康和闭锁卵泡中的表达差异;最后,设计circINHBB的特异性siRNA(si-circINHBB),在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中,转染si-circINHBB及其对照,利用流式细胞术检测circINHBB对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用,预测circRNA可能参与的miRNA调节。【结果】PCR及Sanger测序验证了circINHBB在猪卵泡中的特异性存在,且证实了circINHBB是由INHBB编码基因的mRNA的前体经反向可变剪切形成的环状结构RNA;FISH实验进一步验证了circINHBB在猪卵泡颗粒细胞的细胞质中分布;qRT-PCR结果证实,与猪健康卵泡相比,circINHBB的表达量在猪闭锁卵泡中显著降低;流式细胞术检测结果表明当敲减circINHBB后,猪卵泡颗粒细胞的凋亡水平显著上升,说明circINHBB对猪卵泡颗粒细胞的凋亡有显著的抑制作用;生物信息学分析表明,circINHBB可能与10个已知miRNA相互作用,通过TGF-β、Notch等信号通路参与调控颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁过程。【结论】在猪卵泡中验证了circINHBB的环状结构及胞质中的特异性表达分布,证实了其在闭锁卵泡中表达量低于健康卵泡,通过体外实验证实了circINHBB是细胞凋亡的抑制因子,可能通过吸附相关miRNA参与调节卵泡的发育和闭锁过程。

关键词： circRNA circINHBB 卵泡闭锁猪颗粒细胞凋亡

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基于直向同源序列的比较基因组学研究

遗传 2009年第5期31卷 457-463页

作者：潘增祥许丹张金璧林飞吴宝江刘红林南京农业大学动物科技学院南京210095 Division of Laboratory Medicine Nevada Cancer Institute 10441 West Twain Avenue Las Vegas NV 89135

直向同源序列在不同的物种中具有相近甚至相同的功能、相似的调控途径,扮演相似甚至相同的角色,而且,绝大多数核心生物功能就是由相当数量的直向同源基因所承担,它是基因组序列的功能注释与分析中最可靠的选择,其特殊的生物学特性决定:... 详细信息

直向同源序列在不同的物种中具有相近甚至相同的功能、相似的调控途径,扮演相似甚至相同的角色,而且,绝大多数核心生物功能就是由相当数量的直向同源基因所承担,它是基因组序列的功能注释与分析中最可靠的选择,其特殊的生物学特性决定:利用直向同源序列开展比较基因组学研究,必将为探测不同生物在进化过程中重要功能基因的出现、表达和丢失提供线索。文章从直向同源基因的基本特性、直向同源序列与比较基因组学的关系、应用直向同源序列开展比较基因组学相关研究方法、现状等展开综述。

关键词：直向同源比较基因组学生物学特性数据库

南阳黑猪肌内脂质沉积相关lncRNA鉴定和功能预测

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江苏农业科学 2023年第12期51卷 149-157页

作者：刘京鸽吴结革徐世永陈清马凡华张金璧金陵科技学院动物科学与食品工程学院江苏南京210038

为了探讨长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在南阳黑猪肌内脂肪沉积中的重要作用,通过分析已发表的南阳黑猪高脂组和低脂组背最长肌转录组数据,通过编码潜能预测获得可能的lncRNA,结合DESeq2软件筛选出在南阳黑猪高脂组和低脂... 详细信息

为了探讨长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在南阳黑猪肌内脂肪沉积中的重要作用,通过分析已发表的南阳黑猪高脂组和低脂组背最长肌转录组数据,通过编码潜能预测获得可能的lncRNA,结合DESeq2软件筛选出在南阳黑猪高脂组和低脂组背最长肌差异表达基因和lncRNA,并通过GO和KEGG通路富集分析,找出与南阳黑猪肌内脂肪沉积相关的差异表达lncRNA。结果表明,通过编码潜能预测获得61个新的lncRNAs,新鉴定lncRNAs和已知lncRNAs与编码基因相比较表现出一些典型特征,如转录本长度较短、外显子数较少。差异表达分析发现,814个编码基因和98个lncRNA在低脂和高脂组背最长肌间差异表达。差异表达的基因参与了多种与脂质代谢相关的信号通路,如甘油三脂代谢、PPAR信号通路、脂肪酸生物合成、脂肪酸降解等。联合差异表达lncRNAs的靶基因预测和差异表达基因结果分析表明,一些lncRNA可能作用于潜在的靶基因,参与脂质代谢过程,调控背最长肌脂质沉积。研究结果为进一步深入研究与猪脂质沉积相关的lncRNA生物学功能及调控机制奠定了基础,在未来育种中改善猪肉性状,促进猪的选择进程。

关键词：南阳黑猪背最长肌 lncRNA 脂质代谢