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鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建PTHrp基因真核表达载体

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中国矫形外科杂志 2005年第19期13卷 1489-1491页

作者：黄仕龙陈安民郭风劲张衣北华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科武汉430030

[目的]分离、鉴定大鼠骨骺生长板增殖区软骨细胞,克隆甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrp)基因并构建真核表达载体pEGFP-IRES2-PTHrp。[方法]Percoll不连续密度梯度离心法分离生长板增殖区软骨细胞,用X型胶原抗体和电镜鉴定,提取总RNA,RT-PCR... 详细信息

[目的]分离、鉴定大鼠骨骺生长板增殖区软骨细胞,克隆甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrp)基因并构建真核表达载体pEGFP-IRES2-PTHrp。[方法]Percoll不连续密度梯度离心法分离生长板增殖区软骨细胞,用X型胶原抗体和电镜鉴定,提取总RNA,RT-PCR方法获得PTHrp基因的全长cDNA,插入pCR2·1TA克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRES2。[结果]分离出增殖区软骨细胞,经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。[结论]准确分离增殖区软骨细胞并成功构建了PTHrp基因的真核表达载体,为进一步揭示PTHrp的生物学功能及其在在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定了基础。

关键词： PTHrp基因质粒增殖区软骨细胞表达载体基因真核表达载体分离鉴定 PTHrp 克隆载体增殖鼠骨甲状旁腺激素相关蛋白 DNA序列测定区细胞

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UTI抑制骨肉瘤细胞侵袭与转移的实验研究

肿瘤防治研究 2006年第5期33卷 355-357,384页

作者：张衣北陈安民郭风劲武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科 430030

目的体外研究尿胰蛋白酶抑制剂(urinary trypsininhibitor,UTI)抑制人骨肉瘤细胞系MG-63细胞的侵袭与转移。方法在体外培养的MG-63细胞培养基中加入不同浓度的UTI,对照组中加入50μl PBS缓冲液,用免疫组化、RT-PCR和Western blot方法检... 详细信息

目的体外研究尿胰蛋白酶抑制剂(urinary trypsininhibitor,UTI)抑制人骨肉瘤细胞系MG-63细胞的侵袭与转移。方法在体外培养的MG-63细胞培养基中加入不同浓度的UTI,对照组中加入50μl PBS缓冲液,用免疫组化、RT-PCR和Western blot方法检测尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinasetype plasminogen activator,UPA)的表达情况。结果免疫组化染色、RT-PCR及Western blot检测发现随着UTI浓度的逐渐增加,UPA表达量逐渐减少,当UTI浓度增加到100nM时,抑制作用明显(P<0.05),并且呈剂量依赖性。结论UTI不但从mRNA水平,而且从蛋白质水平抑制骨肉瘤细胞表达UPA,从而抑制骨肉瘤细胞侵袭与转移。

关键词：尿胰蛋白酶抑制剂尿激酶型纤溶酶原激活物骨肉瘤

脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir增强神经胶质瘤放射治疗敏感性的实验研究

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中华小儿外科杂志 2018年第5期39卷 356-362页

作者：李舰邹辉黄杰熊军余毅王代旭张衣北华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院骨外科武汉430014 华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院神经外科武汉430014

目的初步研究神经胶质瘤的放射治疗（放疗）抵抗效应中脂肪酸代谢变化,以期为提高放疗效果提供理论依据.方法用60 Gy剂量照射体外培养胶质瘤细胞GBM1、GBM2和GBM3,分析比较存活下来的放疗抗性细胞（Treatment-resistant glioblastoma ... 详细信息

目的初步研究神经胶质瘤的放射治疗（放疗）抵抗效应中脂肪酸代谢变化,以期为提高放疗效果提供理论依据.方法用60 Gy剂量照射体外培养胶质瘤细胞GBM1、GBM2和GBM3,分析比较存活下来的放疗抗性细胞（Treatment-resistant glioblastoma clones,TRGC）和未经放疗处理的肿瘤细胞（treatment-sensitive glioblastoma clones,TSGC）之间AMPK、Akt和NAD＋等能量代谢差异,并用基因芯片差异分析系统比较两者之间代谢调节基因的表达变化,根据脂肪酸代谢相关基因表达差异,选用脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir抑制GBM1、GBM2和GBM3脂肪酸代谢后的放疗效果.结果经过60Gy剂量照射后的GBM1、GBM2和GBM3分别在照射结束后的第181、66和233天形成放疗抗性克隆TRGC,与TSGC细胞克隆相比,生成的活化AMPK、Akt和NAD＋明显增多,脂肪酸代谢调节基因TXNIP、EGR1、ALDH3A2、PLD3、SLC38A1和OSBPL8等基因明显增高.与单独用4 Gy剂量放疗处理的TRGC克隆只有极少数细胞凋亡相比,用脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir抑制脂肪酸代谢后再用4Gy低剂量放疗处理的TRGC出现大量细胞凋亡,即使培养4周后形成的新克隆小且稀疏.结论脂肪酸氧化代谢与胶质瘤细胞的放疗抵抗有关,抑制脂肪酸氧化代谢后明显增加胶质瘤细胞的放射治疗效果.

关键词：神经胶质瘤放射疗法脂肪酸抗氧化剂

Notch1信号系统对骨骺干细胞增殖与分化调控作用的初步观察

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中华医学杂志 2005年第48期85卷 3430-3434页

作者：张衣北陈安民郭风劲黄仕龙熊文化李琪华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科武汉430030

目的研究激活的Notch1信号系统对体外培养的骨骺干细胞增殖与分化的调控作用。方法向体外培养的骨骺干细胞中分别加入Notch1激活剂rhNF-κB和抑制剂γ-secretaseinhibitorⅡ(MW167),空白对照加PBS缓冲液。用RT-PCR、免疫组化、MTT、流... 详细信息

目的研究激活的Notch1信号系统对体外培养的骨骺干细胞增殖与分化的调控作用。方法向体外培养的骨骺干细胞中分别加入Notch1激活剂rhNF-κB和抑制剂γ-secretaseinhibitorⅡ(MW167),空白对照加PBS缓冲液。用RT-PCR、免疫组化、MTT、流式细胞仪、碱性磷酸酶染色和Western印迹方法检测。结果骨骺干细胞中有Notch1和Jagged1表达;与对照组相比,rhNF-κB诱导组表达PCNA、胶原Ⅱ蛋白明显增多,促细胞增殖作用明显(P=0.027),并且进入分裂期(S期)的细胞增多(26.54%),而MW167诱导组碱性磷酸酶、CollagenⅩ蛋白表达明显增多,胶原Ⅱ蛋白及分化标志蛋白stathmin表达明显减少。结论当Notch信号系统被激活时,骨骺干细胞进行增殖;当Notch信号系统被抑制时,骨骺干细胞进行分化。

关键词：信号传递系统干细胞细胞分化调控作用 Notch1信号系统骨骺

激活的Notch1信号系统抑制前软骨干细胞凋亡及其机制研究

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中华小儿外科杂志 2006年第11期27卷 592-595页

作者：张衣北陈安民郭风劲黄士龙华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科武汉430030

目的研究激活的Notch1信号系统抑制体外培养的前软骨干细胞(precartilainous stem cells,PSCs)凋亡及其机制。方法用RT-PCR检测PSCs细胞中Notch信号系统的表达,并分别向培养细胞中加入Notch1激活剂rhNF-kB、抑制剂γ-secretase inhibito... 详细信息

目的研究激活的Notch1信号系统抑制体外培养的前软骨干细胞(precartilainous stem cells,PSCs)凋亡及其机制。方法用RT-PCR检测PSCs细胞中Notch信号系统的表达,并分别向培养细胞中加入Notch1激活剂rhNF-kB、抑制剂γ-secretase inhibitorⅡ(MW167)和Bcl-2抑制剂HA 14-1,空白对照加PBS缓冲液,在凋亡诱导剂Celecoxib诱导后,用MTT检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡和Western Blot检测Hes-1及Bcl-2蛋白的表达。结果PSCs细胞中存在Notch1／Jagged1信号通路,rhNF-kB组细胞活力增加,凋亡较少,Hes-1蛋白和Bcl-2蛋白表达明显增加,而MW167组、HA 14-1组和对照组细胞凋亡明显,差异有显著性意义(P<0．05),且HA 14-1组和HA 14-1协同rhNF-kB组无Bcl-2表达。结论激活的Notch1信号系统通过促进靶基因Hes-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来抑制PSCs细胞凋亡。

关键词： Notch信号系统前软骨干细胞凋亡

PIN1反义基因转染抑制人骨肉瘤细胞的增殖

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肿瘤 2006年第1期26卷 32-36页

作者：熊文化陈安民郭风劲张衣北黄涛华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科武汉430030

目的观察以pIRES2-EGFP质粒为载体的PIN1反义基因转染对人骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。方法不同量(0、20、50、100、200、250μL)的PIN1反义基因以pIRES2-EGFP质粒为载体包装后转染人骨肉瘤MG-63细胞,收集转染前后的培养细胞和上清液,MT... 详细信息

目的观察以pIRES2-EGFP质粒为载体的PIN1反义基因转染对人骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。方法不同量(0、20、50、100、200、250μL)的PIN1反义基因以pIRES2-EGFP质粒为载体包装后转染人骨肉瘤MG-63细胞,收集转染前后的培养细胞和上清液,MTT法观测转染前后细胞生长曲线;流式细胞仪观测细胞生长周期变化和细胞凋亡情况;Western blot法检测PIN1蛋白的表达变化;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PIN1mRNA表达变化。结果MTT法和流式细胞仪检测显示反义PIN1基因转染后,MG-63细胞生长受到抑制,且其凋亡被促进;Western blot结果表明转染反义PIN1基因的量越多,其PIN1蛋白表达量越低,测得空白对照组及不同量转染组的光密度比值分别为0.854±0.136、0.866±0.138、0.732±0.154、0.611±0.121、0.547±0.109、0.398±0.113、0.320±0.151,差异有显著性(P<0.05);RT-PCR检测其光密度比值分别为0.983±0.125、0.988±0.127、0.915±0.157、0.786±0.125、0.608±0.124、0.433±0.130、0.410±0.158,差异有显著性(P<0.05)。结论反义PIN1基因可封闭PIN1mRNA,使MG-63细胞表达的PIN1蛋白减少,从而抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖。

关键词：骨肉瘤异构酶类基因,PIN1 转染寡核苷酸类,反义 MG-63细胞

骨唾液酸蛋白的表达对骨肉瘤细胞侵袭转移特性的影响

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肿瘤防治研究 2007年第2期34卷 96-99页

作者：黄涛陈安民郭风劲张衣北廖晖华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科武汉430030

目的构建人骨唾液酸蛋白(BSP)正反义真核表达载体,研究其对骨肉瘤细胞侵袭转移特性的影响。方法以PCR的方法扩增人BSP的开放阅读框序列,与载体pIRES2-EGFP相连构成重组正反义表达质粒。以脂质体介导转染入MG-63细胞,通过Westernblot检... 详细信息

目的构建人骨唾液酸蛋白(BSP)正反义真核表达载体,研究其对骨肉瘤细胞侵袭转移特性的影响。方法以PCR的方法扩增人BSP的开放阅读框序列,与载体pIRES2-EGFP相连构成重组正反义表达质粒。以脂质体介导转染入MG-63细胞,通过Westernblot检测细胞中蛋白的表达。以重组基底膜侵袭实验和划痕实验测定对骨肉瘤细胞侵袭力的影响。结果成功构建了人BSP正反义核酸真核表达载体,转染后有效表达hBSP,与对照组相比,正义载体转染后使MG-63细胞中hBSP蛋白表达水平升高,侵袭力增强;反义载体转染后使MG-63细胞中hBSP蛋白表达水平降低,侵袭力受到抑制。结论BSP表达的改变可能在骨肉瘤的浸润转移过程中起重要作用,BSP表达下调可以抑制骨肉瘤的侵袭能力。

关键词：骨唾液酸蛋白基因基因表达肿瘤转移骨肉瘤

Expression of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Human Osteosarcoma Cells Transfected with Adeno-associated Virus-antisense VEGF

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Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences) 2004年第3期24卷 279-280,283页

作者：徐卫国陈安民张衣北易成腊 Department of Orthopaedics Tongji HospitalTongji Medical College Huazhong University of Science and Technology Wuhan 430030 China

Summary: The expression of protein vascular endothelial growth factor (VEGF) in osteosarcoma cells transfected with adeno-associated virus (rAAV)-antisense VEGF was studied to provide the foundation of osteosarcoma treatment through antivascularization. The rAAV-antisense VEGF at different doses (0, 20, 50, 100, 200, 240 μl) was transfected into osteosarcoma MG-63 cell. The cells and culture supernatants were collected before and after tansfection. The expression of VEGF protein was detected by using immunohistochemical staining (SP) and Western blot. SP and Western-blot tests revealed that the MG-63 Cells transfected with rAAV-antisense VEGF had less staining than those without transfection with rAAV-antisense VEGF, and the staining intensity was negatively correlated with the doses of genes. The corresponding A values of transfected genes with different doses of rAAV-antisense VEGF (0, 20, 50, 100, 200, 240 μl) were 86 614±13 776, 73 245±15 414, 61 078±12 124, 54 657±10 953, 39 802±11 308, 32 014±15 057 respectively, with the difference being significant (P<0.05). It was concluded that the expression of VEGF protein in MG-63 cells could be inhibited by rAAV-antisense VEGF.

关键词： adeno-associated virus antisense vascular endothelial growth factor gene transfection osteosarcoma

外磁场作用下特异性磁性NICD对脊髓神经干细胞增殖与凋亡的影响

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华中医学杂志 2009年第6期33卷 297-299页

作者：张衣北夏春陈安民厦门大学附属中山医院骨科厦门361004 华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科武汉430030

目的研究Notch信号通路在脊髓损伤部位高表达后,对内源性脊髓神经干细胞再生能力的影响,探讨其在脊髓损伤修复中的作用。方法构建鼠NICD(Notch intracellular domain,NICD)质粒,用经典的氧化还原法将NICD质粒结合至葡聚糖磁性纳米颗粒(d... 详细信息

目的研究Notch信号通路在脊髓损伤部位高表达后,对内源性脊髓神经干细胞再生能力的影响,探讨其在脊髓损伤修复中的作用。方法构建鼠NICD(Notch intracellular domain,NICD)质粒,用经典的氧化还原法将NICD质粒结合至葡聚糖磁性纳米颗粒(dextran magnetic nanoparticles,DMN)上,参照Alivisatos和Conwell方法构建纳米化目的基因,在外磁场作用下转染体外培养鼠脊髓神经干细胞,检测转染前后细胞增殖与凋亡情况。结果纳米化NICD-DMN转染体外培养内源性脊髓神经干细胞后,细胞明显增多,而凋亡明显减少,统计学有显著意义(P<0.05)。结论特异性磁性NICD在外磁场协助下明显促进内源性脊髓干细胞增殖,抑制其凋亡。

关键词：脊髓神经干细胞纳米颗粒 NICD