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CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统研究

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CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统研究

作者：张潇筠西北农林科技大学

学位级别：硕士

CRISPR基因编辑工具的衍生技术迅速在生命科学、生物医学以及动植物育种领域得到应用。基于基因编辑技术的新兴分子设计育种可以达到快速改良动物在育种的目的。同源重组修复(homology-directed repair,HDR)是基因敲入和精确编辑的重要... 详细信息

CRISPR基因编辑工具的衍生技术迅速在生命科学、生物医学以及动植物育种领域得到应用。基于基因编辑技术的新兴分子设计育种可以达到快速改良动物在育种的目的。同源重组修复(homology-directed repair,HDR)是基因敲入和精确编辑的重要策略,但是其编辑效率仍然有待提高。基于将供体DNA驱动富集至双链断裂处(double-stranded break,DSB)的思路,已有几套CRISPR/Cas9衍生系统被报道用于提高HD R的基因编辑效率。本文使用供体适配系统(Donor Adapting System,DAS)一词来概括那些用适配子修饰CRISPR/Cas9系统以达到驱动与适配接头融合连接的供体DNA的基因编辑策略。同时设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配系统,将酵母Gal4蛋白中的DNA结合域与Cas9蛋白进行融合表达,利用PCR设计在双链DNA供体上添加与其特异性结合的序列(Binding Sequence,BS),使其能够与Cas9-Gal4BD融合蛋白进行结合同时在DBS处募集达到较高的有效浓度,从而提高HDR效率的一套编辑系统。并对CRISPR/Cas9-Gal4BD系统的融合设计和供体进行优化验证,并使用优化后的系统在基因组上进行精确编辑。本研究的主要结果如下:1.使用重组DNA技术构建了CRISPR/Cas9-GGS1-Gal4BD、CRISPR/Cas9-GGS3-Gal4BD、CRISPR/Cas9-GGS5-Gal4BD等主要表达载体及其相关报告载体。2.将酵母转录因子Gal4的DNA结合域(Gal4 BD)和能够特异性的识别并结合的特异性结合序列(Binding Sequence,BS)引入CIRSPR/Cas9系统及双链DNA(ds DNA)供体。构建CIRSPR/Cas9-Gal4BD供体适配系统。3.通过SSA活性报告试验对CIRSPR/Cas9-Gal4BD融合方式进行优化设计试验,获得以GGS5(5个重复GGS序列)作为连接linker同时Gal4BD蛋白融合在Cas9蛋白C端的融合对Cas9蛋白活性和表达影响最小。4.通过HDR效率报告试验进一步对BS-ds DNA供体进行优化设计试验,发现单个BS序列添加在PCR双链供体的5’端的BS-ds DNA供体设计方案的HDR效率比其他设计高出20～60%。5.使用优化后的Cas9-Gal4BD融合表达方案和BS-ds DNA供体设计方案对HEK293T细胞基因组进行精确编辑。在选择的四个基因位点(AAVS1,***5,VEGFA)上进行编辑后的结果显示,有三个基因位点的HDR编辑的效率提高了20%同时发现本系统对CRISPR/Cas9系统的脱靶效应具有抑制作用。

关键词： CRISPR/Cas9系统 HDR Cas9-Gal4BD融合表达供体适配双链DNA供体

一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

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生物工程学报 2023年第10期39卷 4204-4218页

作者：马宝霞崔婕妤钱泓润张潇筠杨森张骐镜韩艺帆张智英王建刚徐坤西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高... 详细信息

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌(Streptococcus pyogenes)源的SpCas9和路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统(donor adapting system,DAS)。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复(homology-directed repair,HDR)效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacIDAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。

关键词：基因编辑 CRISPR/Cas9 LacI基因 LacO序列供体适配

一种新型提高HDR效率的 CRISPR/Cas9-Gal4BD 供体适配基因编辑系统

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遗传 2022年第8期44卷 708-719页

作者：张潇筠徐坤沈俊岑穆璐钱泓润崔婕妤马宝霞陈知龙张智英魏泽辉西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100

近年来,CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展,在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break,DSB)同源指导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的... 详细信息

近年来,CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展,在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break,DSB)同源指导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的重要策略,但效率偏低亟待提高。本文提出了驱动供体DNA富集至DSB处以提高HDR效率的新策略,并设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统(donor adapting system,DAS)。该系统主要利用Gal4 DNA结合域(Gal4 binding domain,Gal4BD)作为配体蛋白与Cas9融合表达,将Gal4BD结合序列(Gal4 binding sequence,Gal4BS)作为受体序列与双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体结合,以期提高HDR效率。使用***报告细胞系的初步研究结果表明当dsDNA供体同源臂在一定长度(100~60 bp)时该系统能够提高HDR效率2~4倍。进一步的优化研究表明,融合端口和融合使用连接子(linker)的选择会影响Cas9表达效果及活性,而GGS5作为Cas9-Gal4BD融合的连接子则影响较小。同时,本研究还发现Gal4BS-dsDNA供体的差异化设计也会影响HDR效率,将Gal4BS添加到dsDNA供体5′-端的效果最佳。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS在AAVS1和EMX1位点上实现了HDR编辑效率的提高,为进一步利用该系统进行动物分子设计育种研究提供了参考和借鉴。

关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑供体DNA 供体适配同源指导修复

和谐共融探索未来——“2023世界音乐周”综述

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中央音乐学院学报 2024年第1期174卷 168-176,F0003页

作者：张潇雨中央音乐学院音乐学系

2023年12月1日至6日,“2023世界音乐周”系列活动在北京成功举办。此次世界音乐周由中央音乐学院与中国宋庆龄青少年科技文化交流中心联合主办,中央音乐学院音乐学系与中国宋庆龄青少年科技文化交流中心艺术中心承办,中央音乐学院国际... 详细信息

2023年12月1日至6日,“2023世界音乐周”系列活动在北京成功举办。此次世界音乐周由中央音乐学院与中国宋庆龄青少年科技文化交流中心联合主办,中央音乐学院音乐学系与中国宋庆龄青少年科技文化交流中心艺术中心承办,中央音乐学院国际交流处、中国音乐家协会世界民族音乐学会、中国世界民族音乐教学研究会、《中央音乐学院学报》编辑部、中央音乐学院科研处、中国科教电影电视协会教育委员会、中国学院奖组织委员会协办。

关键词：中央音乐学院中国音乐家协会教学研究会科研处学院奖国际交流处宋庆龄音乐学系

改进Faster R-CNN算法及其在垃圾分类中的应用

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改进Faster R-CNN算法及其在垃圾分类中的应用

作者：张潇长春工业大学

学位级别：硕士

道德与皇权的交涉——宋明儒《大学》“亲”“新”之辩的学理动机

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东岳论丛 2024年第6期45卷 91-97页

作者：刘雷张潇潇山东大学儒学高等研究院山东济南250100

《大学》“亲民”说之所以成为宋代以来聚讼不已的学术公案,乃在于其聚焦了儒家“为政以德”即以道德学说来引导为政者“养民”“安民”的学理动机与学术志向。二程以道德提挈皇权、朱子以道德贯通君民、阳明重振道德体用说等围绕《大... 详细信息

《大学》“亲民”说之所以成为宋代以来聚讼不已的学术公案,乃在于其聚焦了儒家“为政以德”即以道德学说来引导为政者“养民”“安民”的学理动机与学术志向。二程以道德提挈皇权、朱子以道德贯通君民、阳明重振道德体用说等围绕《大学》“亲民”“新民”说的论辩,工夫路径虽有不同,却无不竭力以各自主张的道德学说与皇权及其隐匿之下的极端权力欲望现象进行交涉,试图以此来扼制私欲、匡正皇权制度下“养民”“安民”的治道,从而发展出良好的国家社会形态。显然,他们的努力和理想未能全面转化为政治制度与社会现实,却足以为十九世纪以来中国思想界、政治制度及社会发展提供重要的理论反思。

关键词：《大学》亲民新民道德皇权

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基于Zabbix的城市轨道交通智能运维体系集中监控平台建设

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城市轨道交通研究 2024年第S1期27卷 110-115页

作者：张潇帅上海地铁维护保障有限公司网络中央维护部上海200235

[目的]在大规模监控需求下,智能运维体系需耗费大量资源,而且中小型系统还易被遗漏,因此需建设集中监控平台,以实现智能运维体系下的全面监控。[方法]以上海轨道交通蒲汇塘数字化运维中心Zabbix集中监控平台为例,分析了蒲汇塘数字化运... 详细信息

[目的]在大规模监控需求下,智能运维体系需耗费大量资源,而且中小型系统还易被遗漏,因此需建设集中监控平台,以实现智能运维体系下的全面监控。[方法]以上海轨道交通蒲汇塘数字化运维中心Zabbix集中监控平台为例,分析了蒲汇塘数字化运维中心集中监控平台的建设需求;分析了选取Zabbix为监控软件的理由,介绍了Zabbix的基本功能和系统架构;介绍了Zabbix集中监测平台的功能设计和实施方案;分析了Zabbix集中监控平台的应用效果,并提出了优化建议。[结果及结论]使用Zabbix集中监控平台辅助日常巡检,可大幅提升巡检效率。使用Zabbix集中监控平台辅助排故,可通过监控项直接发现故障点,而且能够跨越专业壁垒,克服多故障节点同时排故的干扰,在快速定位故障点的同时也能根据报警等级判定故障轻重缓急,灵活调整人员分配。Zabbix集中监控平台能够减少人工干预,提高响应速度和效率,优化资源利用,提高系统可靠性和安全性。

关键词：城市轨道交通智能运维集中监控平台 Zabbix

“副号即隐私”:Z世代用户社交媒体信息发布行为特点研究

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情报资料工作 2024年第3期45卷 60-69页

作者：张潇月北京大学信息管理系北京100871

[目的/意义]Z世代用户群体已占据我国社交媒体用户逾半数比例,该群体具备“‘热梗’即语言”、以技术机制对抗社交媒体不利影响、使用需求分层与“类Finsta”文化的特点。了解Z世代用户在社交媒体中的信息发布行为特点,能够为理解其使... 详细信息

[目的/意义]Z世代用户群体已占据我国社交媒体用户逾半数比例,该群体具备“‘热梗’即语言”、以技术机制对抗社交媒体不利影响、使用需求分层与“类Finsta”文化的特点。了解Z世代用户在社交媒体中的信息发布行为特点,能够为理解其使用偏好提供实证参考。[方法/过程]通过理论抽样,对12名在同一社交媒体平台中同时拥有主副账号的Z世代用户开展半结构化访谈,并以扎根理论方式分析访谈转录稿。最终形成Z世代用户对社交媒体的使用目的、隐私认知、人际关系认知、信息接收者认知、社交平台的空间划分和社交媒体信息发布行为这6个理论范畴,并讨论了18个具体范畴间的关系,以及3条用户从主、副账号间的迁移路径。[结果/结论]Z世代用户“去社交化“”情绪表达与自我调节”和“自我发展”的社交媒体使用需求,促进其对社交平台空间的再划分。该信息实践创造并强化了“副号即隐私”的认知,使Z世代用户通过控制信息发布的时空范围、内容语境和发布频次的方式,实现隐私边界的动态平衡。文章同时基于该特征从平台和用户角度讨论了用户体验优化的具体措施。

关键词：社交媒体信息发布信息场理论隐私认知 Z世代

初中语文古诗词“1+X”群文阅读教学策略研究

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初中语文古诗词“1+X”群文阅读教学策略研究

作者：张潇集美大学

学位级别：硕士

《义务教育语文课程标准(2022年版)》对语文教学提出新的要求,即围绕语文核心素养架构课程目标体系,用学习任务群组织课程内容。“1+X”群文阅读是在上述背景下产生的新型教学方法,这种教学方法重视统整教学内容,依托结构化的文本和合... 详细信息

《义务教育语文课程标准(2022年版)》对语文教学提出新的要求,即围绕语文核心素养架构课程目标体系,用学习任务群组织课程内容。“1+X”群文阅读是在上述背景下产生的新型教学方法,这种教学方法重视统整教学内容,依托结构化的文本和合作探究的学习活动,来提升学生阅读实践能力,培育学生语文核心素养,在一定程度上契合新课标要求。古诗词教学是初中语文教学的“重头戏”也是“老大难”的问题,调查发现古诗词教学存在学生学习兴趣不高、教师教学方式单一等问题,因而,古诗词理应成为初中语文教学变革探讨的重要范畴。所以,在初中古诗词教学中运用“1+X”群文阅读,发挥其优势,设置环环相扣的教学策略,以此开拓具体化的古诗词教学路径,这是本研究的目的所在。探究初中古诗词“1+X”群文阅读教学策略涉及以下三个研究问题,即“初中古诗词‘1+X’群文阅读教学现状是怎样的”,这是研究的依据,“初中古诗词‘1+X’群文阅读实际应用效果如何”这是研究的关键,“初中古诗词‘1+X’群文阅读的实践策略是什么”,这是研究的重点。围绕以上三个问题,本研究以“1+X”群文阅读的实践流程为框架,采用问卷调查、访谈等研究手段,分析初中古诗词“1+X”群文阅读教学的现状。并以《春望》为例,进行单篇阅读与“1+X”群文阅读的对比研究,检验该教学法在实际教学中的效果。研究发现,“1+X”群文阅读的最大优势在于强调学生主体性,提升学生的阅读实践能力和语文核心素养。然而,其局限性在于集体建构过程可能失真,缺乏文本细读等。因此,在制定策略时,应充分发挥该教学法的优势,同时努力克服其存在的局限。最终,基于现状调查和实践效果,本研究从议题设置、文本组合、集体建构、群文课型、教学评价和作业设计六个方面制定针对性的教学策略,形成了环环相扣、层层铺叠的实践策略。为初中古诗词“1+X”群文阅读开拓了可行、具体的教学路径,旨在解决初中古诗词教学的现实问题,丰富古诗词教学理论,并实质性地提升学生的阅读实践能力,发展学生的语文核心素养。

关键词：古诗词 “1+X”群文阅读教学策略