检索结果-南通市图书馆

作者：张梦筱东北大学

学位级别：硕士

随着互联网、物联网、云计算和软件即服务等相关信息领域的快速发展,由此产生的个人、企业和公共数据正以惊人的速度持续增长。我们无疑正处于大数据的时代。这些数据可以帮助企业进行理性的商业决策,也可以帮助研究人员基于真实数据进... 详细信息

随着互联网、物联网、云计算和软件即服务等相关信息领域的快速发展,由此产生的个人、企业和公共数据正以惊人的速度持续增长。我们无疑正处于大数据的时代。这些数据可以帮助企业进行理性的商业决策,也可以帮助研究人员基于真实数据进行有意义的科学研究,因此数据对于各个行业来说都蕴含着巨大的价值。同时,数据交易平台如Windows Azure、Infochimps、Xignite和国内的贵阳大数据交易所的涌现,也印证了数据的巨大价值,并且这些数据交易平台正在逐步将数据商品化。在数据集市上,数据正如传统的物理产品一样,经过加工、生产成为产品,以适当的价格销售给数据需求者。但是如何正确衡量数据的价值?如何合理确定数据的销售价格?以及如何合理设计数据产品?等一系列的问题也随之而来。当前的数据市场中的定价策略主要包括免费、按次付费、固定费用等,而国内的数据交易主要通过撮合定价等离线交易进行。可以发现,当前的定价机制缺乏标准化的定价模型,对数据的本质属性缺乏考虑,因此数据定价策略是一个值得关注的研究问题,具有重要的理论意义和现实意义。本文正是基于这样的背景,提出了基于顾客自我选择的数据定价策略研究问题,研究了数据产品的差异化设计和定价策略。主要研究内容和创新性工作包括:(1)介绍了数据市场的基本概念和当前的定价策略,描述了数据产品的属性和特征。综合评述了关于信息产品和服务定价、数据产品和服务定价的相关研究。(2)考虑数据质量的数据定价策略问题。首先,数据质量是决定数据价值的最主要的因素之一,可是当前数据市场中的定价策略却鲜有考虑这一因素,而现有关于数据定价研究的文献也很少考虑,因此本文首先从数据的质量出发,研究了多维数据质量对定价策略的影响。之后,将数据质量问题拓展到另一方面,考虑数据多个质量维度之间的相互作用对于整体数据质量的影响。同时,将非线性的消费者支付意愿函数纳入数据定价模型,分析其对于数据的版本化设计的影响。这一部分验证了版本化策略的最优性,并提供了数据的最优产品设计和定价策略。(3)同时考虑数据质量与数据规模的数据定价策略问题。在研究多维质量的数据定价问题的基础上,考虑影响数据价值的另一重要因素—数据规模。实际中数据存储采用基于数据规模的非线性定价策略,本文在这一部分提出了一个非线性的成本函数形式,并通过数据结果分析该函数形式对于最优定价策略的影响。(4)考虑质量衰减和数据更新的数据定价策略问题。数据需要不断进行更新,以维持数据的时效性和有用性。数据质量的衰减对于数据的价值和定价策略有重要影响,但是当前少有学者进行相关研究。因此本文提出了数据质量衰减函数,建立了考虑更新的数据定价模型,求解得到了两个销售阶段的最优质量水平、价格和更新时间,并就不同的数据市场分布对于产品设计、定价、数据平台所有者总收益和数据消费者总效用进行了分析。本文提出的基于顾客选择的数据定价方法,考虑了多维数据质量、数据规模和数据更新,提出了数据平台提供者和数据消费者的数学规划模型,有利于建立公平有序的数据交易市场,为数据交易的利益相关者提供决策依据,具有重要的理论和应用价值。

关键词：数据市场数据定价顾客自我选择差异化产品设计双层规划

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ATF3和CK2α过表达促进CHO细胞重组蛋白表达的作用及机制研究

ATF3和CK2α过表达促进CHO细胞重组蛋白表达的作用及机制研究

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作者：张梦筱上海交通大学

学位级别：硕士

背景和目的:中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是重组蛋白、单克隆抗体等生物大分子药物生产的主要宿主细胞之一,尤其适合需要复杂翻译后修饰的分子类型,例如需糖基化的细胞因子、各类全长单克隆抗体等。然而,与大肠杆菌、酵母等表达系统相比,以CH... 详细信息

背景和目的:中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是重组蛋白、单克隆抗体等生物大分子药物生产的主要宿主细胞之一,尤其适合需要复杂翻译后修饰的分子类型,例如需糖基化的细胞因子、各类全长单克隆抗体等。然而,与大肠杆菌、酵母等表达系统相比,以CHO细胞为代表的哺乳动物细胞表达系统的培养成本较高,导致产品价格昂贵、病人难以负担。因此,提高CHO工程细胞株的生长性能及外源蛋白表达能力,对降低药物成本、进而提高市场可及性具有重要意义。以往研究证实,培养基和培养条件优化、筛选外源基因整合位点等方式能够有效提高CHO的生长及表达水平,而近年来,随着高通量测序、高效基因编辑等新兴技术等的涌现,使得功能基因筛选及CHO细胞的精确基因编辑成为可能。本实验室前期进行了CHO细胞的DNA甲基转移酶3A(DNMT3a)敲除,在此基础上通过RNA-seq发现转录激活因子3(ATF3)基因受DNMT3a敲除的影响出现转录水平上调,可能与CHO细胞的生长、代谢及表达水平的变化相关。另一方面,本实验室采用规律成簇的间隔短回文重复/规律成簇的间隔短回文重复结合蛋白9(CRISPR/Cas9)建立了CHO细胞的基因敲除及外源基因整合技术,并筛选到C12orf35、HPRT等稳定性较好的外源基因整合位点,可用于基因定点整合的稳定细胞株建立。本研究中,我们结合前期研究及文献检索,选取具有细胞生长代谢调节功能的ATF3及酪蛋白激酶Ⅱ的α亚基(CK2α)两个基因,深入研究其过表达对CHO细胞的作用。方法:为了探究ATF3和CK2α两个基因对CHO细胞增殖和外源蛋白表达的作用,首先我们构建了瞬时表达ATF3和CK2α的质粒,并将这两种质粒各自转染到红色荧光蛋白(mCherry)稳定表达的CHO细胞株KCSG6中,通过转染后1～5天细胞计数、培养结束时m Cherry蛋白的表达水平检测,来初步评价ATF3和CK2α基因过表达对CHO细胞生长及蛋白表达的影响。为了更严谨地研究ATF3和CK2α两个基因的功能,我们采用CRISPR/Cas9介导的稳定细胞株构建技术,选取HPRT作为整合位点,选取向导RNA(sgRNA)序列,并设计和构建定点整合的Donor质粒ATF3-Donor、CK2α-Donor和ATF3+CK2α-Donor。在KCSG6细胞株上通过电转染、加压筛选以及5’/3’junction PCR的鉴定,获得相应的稳转细胞池,并通过有限稀释法铺板,对得到的单克隆细胞进行5’/3’junction PCR和OUT-OUT PCR的鉴定和测序等鉴定,挑选KCSG6细胞株背景下的ATF3、CK2α以及ATF3+CK2α过表达的细胞株。通过对所筛选到的稳定细胞株进行插入基因表达验证、生长特性以及模式蛋白表达水平检测,并进一步探究插入基因对CHO细胞凋亡和相关信号通路的影响,系统地研究ATF3和CK2α两个基因对CHO细胞的作用和机制。结果:通过瞬时转染ATF3和CK2α质粒进入KCSG6细胞,我们发现ATF3和CK2α对细胞增殖及蛋白表达均具有促进趋势。经过CRISPR/Cas9基因编辑技术将ATF3基因、CK2α基因以及ATF3+CK2α基因成功插入KCSG6细胞株的HPRT位点,最终成功得到3株稳转细胞株:ATF3-8、CK2α-3、AC-2。通过对这三株细胞进行相关性质的探究,证明目的基因定点整合到HPRT位点,并得到成功表达,且ATF3和CK2α对CHO细胞增殖具有促进作用,CK2α对mCherry总蛋白的产量具有促进作用。通过对比这3株细胞株与对照细胞株的细胞凋亡,我们发现AC-2细胞株的ATF3+CK2α过表达具有抑制细胞凋亡的作用,而单独的ATF3或CK2α基因无明显作用;通过对这3株细胞株的信号通路进行初步探究,发现相对于空白细胞,这3株细胞的ERK信号通路水平上调。其中,对DNMT3a敲除的CHO细胞进一步研究发现,ATF3基因的启动子区胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)甲基化水平受DNMT3a调控,这对理解ATF3的调控机制具有一定的启示。综上,本研究证实ATF3基因以及CK2α基因过表达对CHO细胞增殖具有促进作用且CK2α对于细胞总蛋白表达具有促进作用,提示该细胞改造策略具有重要意义。本研究中我们还获得了ATF3及CK2α基因过表达的CHO稳定细胞株,可结合细胞培养工艺优化等进行更深入的研究,不断提高CHO细胞培养和蛋白生产水平。

关键词： CHO细胞 CRISPR/Cas9 ATF3 CK2α 稳定细胞株

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抗体药物表达技术最新进展

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生物工程学报 2019年第2期35卷 171-182页

作者：张梦筱朱建伟路慧丽上海交通大学药学院细胞工程及抗体药物教育部工程研究中心上海200240

生物技术药物是21世纪医药工业发展的中坚力量,其中单克隆抗体类药物是生物技术药物的典型代表,是恶性肿瘤、自身免疫病等领域全球销售额最高的药品种类。在抗体药物发展的几十年里,随着基因工程、蛋白质工程等领域的发展,抗体生产的宿... 详细信息

生物技术药物是21世纪医药工业发展的中坚力量,其中单克隆抗体类药物是生物技术药物的典型代表,是恶性肿瘤、自身免疫病等领域全球销售额最高的药品种类。在抗体药物发展的几十年里,随着基因工程、蛋白质工程等领域的发展,抗体生产的宿主细胞建立、表达、纯化等各阶段的技术均不断取得突破,文中综述和讨论了抗体药物生产所采用的真核哺乳动物细胞表达系统、原核大肠杆菌表达系统、转基因动物反应器、无细胞蛋白质合成系统以及相关的关键技术进展。

关键词：抗体药物表达系统哺乳动物细胞生产 CRISPR

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CHO细胞中DNMT3A对ATF3基因甲基化的影响

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中国医药工业杂志 2020年第9期51卷 1150-1157页

作者：张梦筱王佳贤朱建伟路慧丽上海交通大学药学院细胞工程及抗体药物教育部工程研究中心上海200240

转录激活因子3(ATF3)是一种早期应激反应基因,能够影响细胞增殖、分化、转化和凋亡。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是重组蛋白、单克隆抗体等生物大分子药物生产的主要宿主细胞之一。ATF3能够促进肿瘤细胞的增殖及抗凋亡等作用,理论上可对CHO... 详细信息

转录激活因子3(ATF3)是一种早期应激反应基因,能够影响细胞增殖、分化、转化和凋亡。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是重组蛋白、单克隆抗体等生物大分子药物生产的主要宿主细胞之一。ATF3能够促进肿瘤细胞的增殖及抗凋亡等作用,理论上可对CHO细胞发挥调节作用。因此本试验对CHO细胞中ATF3的甲基化水平进行深入研究,通过重亚硫酸盐测序法检测CHO-K1细胞中ATF3的甲基化水平,发现ATF3启动子区域的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)甲基化高达90%。为了进一步研究ATF3甲基化的上游调控机制,构建了敲除DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)的CHO-K1来研究DNMT3A对ATF3甲基化水平的影响。结果表明,敲除DNMT3A后,CHO-K1细胞中的ATF3甲基化水平降低至0,这充分证明了DNMT3A对ATF3的甲基化的调控作用,为CHO细胞的ATF3基因调控研究以及后续CHO细胞株改造提供了理论依据。

关键词：中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 转录激活因子3(ATF3) CRISPR/Cas9 DNMT3A

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