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作者：张宇秋涵郑州大学

学位级别：硕士

研究背景口腔鳞状细胞癌(OSCC)是指癌症发生在嘴唇的红唇和硬软腭或舌后三分之一的交界处,是最常见的口腔恶性肿瘤,占口腔恶性肿瘤的80-90%。在世界范围内,口腔癌是高发的,发病率占全身恶性肿瘤的第六位。口腔鳞状细胞癌的主要病因和诱... 详细信息

研究背景口腔鳞状细胞癌(OSCC)是指癌症发生在嘴唇的红唇和硬软腭或舌后三分之一的交界处,是最常见的口腔恶性肿瘤,占口腔恶性肿瘤的80-90%。在世界范围内,口腔癌是高发的,发病率占全身恶性肿瘤的第六位。口腔鳞状细胞癌的主要病因和诱发因素有吸烟和饮酒习惯,以及紫外线辐射(特别是唇癌),有时和人类乳头状瘤病毒(HPV)念珠菌感染,营养不足和遗传易感性等因素有关。口腔鳞癌的5年生存率是50%。早期病变,无明显临床症状,预防的方法主要是通过筛查来及早发现。手术在大多数口腔癌的治疗中起着重要的作用,辅以化疗或放射治疗。锌指蛋白750(ZNF750)的缺失和突变和鳞状上皮生物学特性相关,锌指蛋白含有锌指结构,通过肽链中氨基酸残基基团与Zn特异性结合,来稳定多肽空间构型。本文中所研究的ZNF750基因(GenBank Accession ***24702)编码了一种锌指蛋白,通过生物信息学分析得出该蛋白ZNF750包含有ZnF-CH型结构域。近些年来的研究表明,CH型锌指蛋白的异常表达有可能引起不同方面不同程度肿瘤的发生,锌指蛋白相关基因的敲除或干扰对口腔鳞癌细胞的增殖生长能力会产生一定的影响。目前,口腔鳞癌的临床治愈率依旧不高,所以找到与口腔鳞癌相关的灵敏度高特异性好的基因十分重要,是治疗口腔鳞癌的新突破口。在本次研究中,我们首先对ZNF750进行了生物信息学分析预测,并根据其碱基序列设计并合成shRNA,采用慢病毒载体将其有效的整合到人舌鳞癌细胞CAL-27内,以达到持久性的干扰效果,从而对ZNF-750锌指蛋白的表达产生有效的干扰,观察ZNF750基因被沉默后人舌鳞癌细胞CAL-27的存活情况、增殖能力和迁移能力。以β-actin为内参,通过real time PCR检测干扰后细胞内ZNF750基因的转录水平及干扰病毒的干扰效率。使用Western blotting技术检测对应锌指蛋白表达水平的变化。通过划痕实验观察ZNF750基因被沉默时癌细胞的迁移运动与修复能力。采用Transwell实验验证ZNF750过表达后对癌细胞体外侵袭能力的影响。进行常规MTT法检测在ZNF750基因被沉默的条件下细胞的增殖能力。材料与方法1.实验所用载体、菌株及细胞本次研究所用载体包括慢病毒包装质粒pCMV-△8.2,和pCMV-VSV-G;克隆菌为大肠埃希菌DH5α;实验中慢病毒包装所用细胞HEK293T由其他实验室惠赠所得,干扰所用细胞人舌鳞癌细胞CAL-27从天津塞尔生物公司购买所得。***750的生物信息学分析以及shRNA的设计应用NCBI查询ZNF750核苷酸及蛋白序列,利用ExPASy服务器预测理化性质,ProtScale程序分析亲疏水性,TMHMM Server v.2.0预测信号肽、跨膜区,利用SWISS-MODEL在线预测蛋白结构以及SMART服务器预测结构功能域。根据NCBI查询的结果设计ZNF750的shRNA靶点,并送至上海生工公司进行合成,然后构建慢病毒载体进行实验。3.针对ZNF750的RNA干扰及干扰效果分析将包装好的慢病毒对CAL-27进行感染,培养后于倒置荧光显微镜下观察荧光预估慢病毒对细胞的感染效率。用qPCR和Western blotting实验对干扰后ZNF750的转录水平和表达水平;划痕实验观察鳞癌细胞的迁移运动与修复能力;应用Transwell实验观察ZNF750基因沉默后对细胞体外侵袭能力的影响;MTT实验检测干扰后细胞的增殖能力。4.统计学处理应用SPSS17.0统计软件及Graphpad Prism软件对实验结果数据进行整合、处理并分析。采用均数±标准差的数据形式,合理使用各项统计学处理方法,包括两两比较、卡方检验和方差分析,比较实验组和对照组以及正常组间的实验结果,检验水准为α=0.05。结果***750锌指蛋白生物信息学分析及沉默后对口腔鳞癌细胞的影响通过生物信息学分析方法对ZNF750基因分析结果如下:ZNF750全长3218bp,编码蛋白大小约为79kDa,含有一个已知的ZnF-CH功能结构域,不含信号肽,无跨膜区,蛋白无明显疏水性。利用克隆表达技术,成功构建慢病毒载体,经酶切和菌落PCR验证显示条带位置正确,后送至上海生工进行测序,测序结果表明慢病毒载体正确构建。待包装好的慢病毒成功感染鳞癌细胞CAL-27后,进行qPCR和Western blotting实验,实验结果显示经慢病毒干扰后,CAL-27细胞ZNF750基因转录水平与蛋白表达量较正常对照组有明显的下降。划痕实验结果显示干扰组相较对照组,划痕有了明显的修复,宽度明显减小,不过空白组和空质粒对照组划痕也有部分修复。当培养48h后再次观察拍照时,空白组细胞划痕与PM7.1空质粒对照组的划痕修复程度几乎一致,而PM7.1-

关键词：口腔鳞癌 ZNF750锌指蛋白慢病毒载体 RNA干扰

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尿样中对硝基酚高效液相色谱荧光测定

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中国公共卫生 2007年第12期23卷 1459-1460页

作者：赵秀娟赵艳张宇秋张宇吴坤哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室哈尔滨150081

近年来,有毒有害化学污染物对生态环境及人体健康的影响已引起人们高度重视[1].对硝基酚是人体接触硝基苯类同系物后体内产生的主要代谢产物,尿中对硝基酚浓度的测定,被认为是生物学监测和职业病诊断的重要指标.

关键词：高效液相色谱法对硝基酚荧光测定尿样气相色谱法化学污染物职业病诊断生物学监测

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高效液相色谱电化学法检测人体血浆中芹菜素和相关黄酮类化合物

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分析化学 2007年第10期35卷 1517-1520页

作者：赵秀娟赵艳张宇秋吴坤哈尔滨医科大学公共卫生学院哈尔滨医科大学公共卫生学院哈尔滨150081

建立了同时检测人体血浆中芹菜素等5种黄酮类化合物含量的反相高效液相色谱法。血浆样品经固相萃取柱提取后,用Hypersil C18色谱柱分离样品,流动相为甲醇/磷酸水溶液（V/V,2/3,pH2.25）,等度洗脱,流量为1 mL/min,柱温为40℃,用电化学检... 详细信息

建立了同时检测人体血浆中芹菜素等5种黄酮类化合物含量的反相高效液相色谱法。血浆样品经固相萃取柱提取后,用Hypersil C18色谱柱分离样品,流动相为甲醇/磷酸水溶液（V/V,2/3,pH2.25）,等度洗脱,流量为1 mL/min,柱温为40℃,用电化学检测器在直接模式下,1100 mV分析检测待测物,内标法定量。对于全部待测组分r均大于0.99;槲皮素、毛地黄黄酮、山奈酚、芹菜素和异鼠李黄素线性范围分别为3;000、3;900、3;000、5;000和3;400 nmol/L;检出限为1.4;.8 nmol/L。方法的实际样品加标回收率为86.8%;02.9%;相对标准偏差（RSD）低于7.4%（n=3）。方法简便、快速、准确,可用于芹菜素等黄酮类化合物在人体内的生物利用度及膳食干预研究。

关键词：芹菜素高效液相色谱电化学检测器人体血浆

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大豆蛋白及其水解物对大鼠体内胆固醇代谢的影响

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现代预防医学 2008年第2期35卷 246-249页

作者：赵秀娟贾莉张宇秋张宇常佩亮 150081 哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室哈尔滨

[目的]探讨大豆蛋白和大豆活性肽对高胆固醇模型大鼠血浆胆固醇及其有关血脂指标的影响,并对其可能的作用机理加以研究,同时也对大豆蛋白和大豆活性肽在降低胆固醇作用方面进行初步的比较。[方法]4周龄断乳雄性Wistar大鼠,经28d诱发高... 详细信息

[目的]探讨大豆蛋白和大豆活性肽对高胆固醇模型大鼠血浆胆固醇及其有关血脂指标的影响,并对其可能的作用机理加以研究,同时也对大豆蛋白和大豆活性肽在降低胆固醇作用方面进行初步的比较。[方法]4周龄断乳雄性Wistar大鼠,经28d诱发高血胆固醇模型以后,按血浆总胆固醇浓度将动物均衡分为3组,分别喂饲含大豆活性肽、大豆蛋白和酪蛋白的纯合成高脂饲料56d后,断头处死动物。[结果]经28d诱导高脂模型后,实验模型大鼠的TC水平为(2.01±0.26)mmol/L(n=36),阴性对照组大鼠分别为(1.33±0.20)mmol/L(n=10)。高血胆固醇模型大鼠的TC浓度是阴性对照组的1.51倍(P﹤0.05)。高血胆固醇模型大鼠又经56d喂饲含有处理因素的饲料后,酪蛋白组、大豆蛋白组和大豆活性肽组大鼠体重(g)分别增加了198.5、133.1和119.3;TC(mmol/L)水平分别为6.41±0.57、3.99±0.28和3.01±0.37;TG(mmol/L)水平分别为3.73±0.70、2.58±0.86和1.09±0.34;与酪蛋白组相比,大豆蛋白组、大豆活性肽组动物体重及TC,TG含量显著降低(P﹤0.05);大豆活性肽、大豆蛋白的摄入可使大鼠肝脏HMG-CoA还原酶mRNA的表达增强,而对LDL-RmRNA的表达无影响。另外,与大豆蛋白组相比,大豆活性肽组大鼠体重及TC,TG含量显著降低(P﹤0.05)。[结论]大豆蛋白、大豆活性肽的摄入可降低高血胆固醇模型大鼠TC、TG浓度,但对HDL-C水平无显著影响;经统计学检验,大豆活性肽降低胆固醇作用与大豆蛋白相比差异有统计学意义(P﹤0.05)。大豆活性肽、大豆蛋白可影响大鼠肝脏HMG-CoA还原酶mRNA的表达可能是其降低胆固醇的机理之一。

关键词：大豆活性肽大豆蛋白胆固醇大鼠

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大鼠肠道菌群对芹菜素代谢影响

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中国公共卫生 2008年第3期24卷 382-383页

作者：常佩亮夏薇张宇张宇秋赵秀娟哈尔滨医科大学公共卫生学院哈尔滨150081

目的研究大鼠肠道菌群对芹菜素的代谢影响。方法采用SD大鼠的新鲜粪便,用人工肠液溶解后加入芹菜素标准溶液,37℃厌氧孵化后采用(RP-HPLC)方法对芹菜素的代谢情况进行定量分析。结果孵化后1h芹菜素迅速被肠道菌群代谢,随着孵化时间的延... 详细信息

目的研究大鼠肠道菌群对芹菜素的代谢影响。方法采用SD大鼠的新鲜粪便,用人工肠液溶解后加入芹菜素标准溶液,37℃厌氧孵化后采用(RP-HPLC)方法对芹菜素的代谢情况进行定量分析。结果孵化后1h芹菜素迅速被肠道菌群代谢,随着孵化时间的延长,芹菜素被大鼠肠道菌群代谢降解的速度放缓。结论在离体条件下,芹菜素容易被大鼠肠道菌群代谢。

关键词：芹菜素肠道菌群降解高效液相色谱

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玉米胚芽油和猪油负荷后小鼠血脂及脂肪酸谱变化的比较研究

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卫生研究 2013年第5期42卷 809-813页

作者：那立欣张宇秋李莉吴博学牛玉存冯任南哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室哈尔滨150081

目的研究不同油脂负荷后小鼠血脂及脂肪酸谱的变化,从而探讨膳食不同脂肪酸构成对餐后血脂的影响。方法 96只雄性C57BL/6小鼠随机分为玉米胚芽油组和猪油组,空腹状态下按照体重1%分别灌胃玉米胚芽油或猪油。在0、30、60、120、180和240 ... 详细信息

目的研究不同油脂负荷后小鼠血脂及脂肪酸谱的变化,从而探讨膳食不同脂肪酸构成对餐后血脂的影响。方法 96只雄性C57BL/6小鼠随机分为玉米胚芽油组和猪油组,空腹状态下按照体重1%分别灌胃玉米胚芽油或猪油。在0、30、60、120、180和240 min,每组分别随机取8只小鼠,眼球采血,分离血清,检测血脂和脂肪酸谱的变化。结果灌胃猪油组小鼠的血清甘油三酯和总游离脂肪酸在120、180、240 min分别显著高于灌胃玉米胚芽油组小鼠(P<0.05)。分析脂肪酸构成发现,灌胃猪油组小鼠血清饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸水平在60、120、180和240 min均显著高于灌胃玉米胚芽油组小鼠(P<0.05),而多不饱和脂肪酸水平则显著低于灌胃玉米胚芽油组小鼠(P<0.05)。其中,灌胃猪油组小鼠血清棕榈酸和油酸在60、120、180和240 min均显著高于灌胃玉米胚芽油组小鼠(P<0.05),亚油酸和花生四烯酸则显著低于灌胃玉米胚芽油组小鼠(P<0.05)。结论与玉米胚芽油比较,摄入猪油餐后血清甘油三酯和饱和脂肪酸水平更高,因此更容易增加心血管疾病的风险。

关键词：玉米胚芽油猪油膳食脂肪酸餐后血脂脂肪酸谱

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芹菜素人体内代谢研究

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中国公共卫生 2008年第4期24卷 446-447页

作者：赵秀娟夏薇赵艳张宇秋张宇常佩亮吴坤哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研搴哈尔滨150081

目的研究摄入芹菜叶后芹菜素在人体内的吸收、排泄。方法10名健康受试者，男女各半，年龄范围24～28岁，平均体质指数（BMI）为20．37kg／m^2。受试者按2g／（kg·bw）食用芹菜叶并食用不含芹菜素和毛地黄黄酮的食物。在分别摄入芹菜叶... 详细信息

目的研究摄入芹菜叶后芹菜素在人体内的吸收、排泄。方法10名健康受试者，男女各半，年龄范围24～28岁，平均体质指数（BMI）为20．37kg／m^2。受试者按2g／（kg·bw）食用芹菜叶并食用不含芹菜素和毛地黄黄酮的食物。在分别摄入芹菜叶后4，6，7，8，9，10，11和28h，采集血样，并收集24h全尿样。用高效液相色谱-电化学检测器（HPLC—ECD）检测血浆、红细胞和尿中芹菜素含量。结果摄入芹菜叶后．全部受试者血浆中芹菜素浓度呈上升趋势，（7．70±0．82）h血浆芹菜素浓度达最高水平（207．11±97．55）nmol／L．在28h内下降到检出限（2．32nmol／L）以下；受试者尿样中芹菜素平均含量为（2251．72±1304．22）nmol／L24h，相当于摄入量的（0．62±0．37）％；红细胞中芹菜索含量在备时间点差异无统计学意义（P〉0．05）。结论通过食物摄入到体内的芹菜素一部分进入了人体循环系统．可以在体内发挥生物学作用。

关键词：芹菜素吸收芹菜人体

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蔬菜水果的抗氧化活性与总黄酮含量的相关性

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现代预防医学 2010年第7期37卷 1245-1247页

作者：陈伟曹杰张莹张宇秋赵秀娟哈尔滨医科大学公共卫生学院

[目的]研究蔬菜、水果的抗氧化活性与总黄酮的相关性。[方法]采用Ferric Reducing Antioxidant Powerassay,FRAP法和分光光度法测定了51种蔬菜和30种水果的抗氧化活性、总黄酮含量,分析它们之间的相关性。[结果]蔬菜的抗氧化活性与总黄... 详细信息

[目的]研究蔬菜、水果的抗氧化活性与总黄酮的相关性。[方法]采用Ferric Reducing Antioxidant Powerassay,FRAP法和分光光度法测定了51种蔬菜和30种水果的抗氧化活性、总黄酮含量,分析它们之间的相关性。[结果]蔬菜的抗氧化活性与总黄酮之间的相关系数为0.398,水果的抗氧化活性与总黄酮之间的相关系数为0.710。[结论]蔬菜、水果的抗氧化活性与总黄酮含量具有一定的相关性,但不同种类的蔬菜和水果,相关性有一定的差异。

关键词：蔬菜水果抗氧化活性总黄酮相关性

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大豆蛋白对大鼠血浆胆固醇影响及作用机制

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中国公共卫生 2006年第9期22卷 1111-1113页

作者：赵秀娟贾莉牛玉存张宇秋哈尔滨医科大学公共卫生学院哈尔滨150081

目的探讨膳食大豆蛋白对高胆固醇模型大鼠血浆胆固醇及其相关血脂指标的影响及可能的作用机制。方法4周龄断乳雄性Wistar大鼠,诱导高胆固醇模型28 d后,按体重和血浆总胆固醇浓度均衡分为2组,分别喂饲含酪蛋白和大豆蛋白的纯合成高脂饲料... 详细信息

目的探讨膳食大豆蛋白对高胆固醇模型大鼠血浆胆固醇及其相关血脂指标的影响及可能的作用机制。方法4周龄断乳雄性Wistar大鼠,诱导高胆固醇模型28 d后,按体重和血浆总胆固醇浓度均衡分为2组,分别喂饲含酪蛋白和大豆蛋白的纯合成高脂饲料56 d。结果酪蛋白组和大豆蛋白组大鼠TC、甘油三酯(TG)、载脂蛋白B(apoB)含量显著降低,粪胆汁酸排泄量增高。但对高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),载脂蛋白AⅠ(apoA-Ⅰ)水平无影响;同时可见,大豆蛋白可以增强大鼠肝脏3-羟基-3-甲酰基CoA(HMG-CoA)还原酶及低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因的表达。结论大豆蛋白可通过影响apoB、HMG-CoA还原酶及LDL-R基因的表达来改变血浆胆固醇水平,其作用机制还需进一步探讨。

关键词：大豆蛋白胆固醇 HMG—CoA还原酶低密度脂蛋白受体(LDL—R)

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红心萝卜中莱菔烷提取及纯化方法建立

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中国公共卫生 2009年第10期25卷 1256-1257页

作者：张国良赵秀娟张宇秋吴坤哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室哈尔滨150081

莱菔硫烷(sufloraphane,SFN)是一类要存在于十字花科蔬菜中的异硫氰酸盐类物质.研究证实,莱菔硫烷是1种多功能酶诱导物,可在没有明显改变细胞色素合成的情况下,提高Ⅱ相酶的相对含量,在肿瘤发生的多个阶段发挥抑癌作用[1].试验证明,莱... 详细信息

莱菔硫烷(sufloraphane,SFN)是一类要存在于十字花科蔬菜中的异硫氰酸盐类物质.研究证实,莱菔硫烷是1种多功能酶诱导物,可在没有明显改变细胞色素合成的情况下,提高Ⅱ相酶的相对含量,在肿瘤发生的多个阶段发挥抑癌作用[1].试验证明,莱菔烷对结肠癌、乳腺癌及大肠癌等均有很好的防治效果[2-3].本研究根据早期蔬菜中莱菔硫烷含量测定实验,结合经济因素及北方地域特点等综合考虑,选定红心萝卜为本实验主要原料.红心萝卜又称心里美萝卜,十字花科属,原料易得,价格便宜,而且其中的莱菔硫烷含量也很高.本实验旨在建立红心萝卜中莱菔硫烷提取与纯化方法,为其他十字花科蔬菜中莱菔硫烷的制备提供参考数据.

关键词：莱菔硫烷提取与纯化正交设计高效液相色谱(HPLC)

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