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作者：张书环华中农业大学

学位级别：硕士

牛结核病(Bovine Tuberculosis，bTB)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种人兽共患传染病。被国际动物卫生组织(Office International DesEpizooties OIE)定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。国内外的人结核... 详细信息

牛结核病(Bovine Tuberculosis，bTB)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种人兽共患传染病。被国际动物卫生组织(Office International DesEpizooties OIE)定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。国内外的人结核病原学调查均发现，牛分枝杆菌是人结核的重要病因之一。世界卫生组织专家委员会第七次会议报告指出：除非消灭牛结核，否则人类结核病的控制是不会成功的。由于目前为止尚未发现有效药物与疫苗用于牛结核病的防治，一些国家普遍采用的是“检疫-捕杀”政策，即检疫出的阳性牛一律捕杀来实现控制牛结核病。因此，准确而及时的诊断方法对于该病的防治显得尤为重要。OIE唯一推荐的方法是牛型结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test，TST)，结核菌素又称为纯化蛋白衍生物(purified protein derivatives，PPD)，是结核分枝杆菌在液体培养基中生长时产生的代谢物质，含有多种抗原成分，用于检测结核病时敏感性较高。但由于结核菌素可能包含有与其它分枝杆菌相同的非特异性抗原组份，检测时容易出现假阳性;结核菌素皮内变态反应对感染后期的开放性结核及全身性结核不敏感。因此，研究更加敏感特异的结核病新型诊断抗原和诊断方法，是控制牛结核病当务之急。牛分枝杆菌是细胞内寄生菌，MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6是***感染机体后分泌的主要抗原，诱导机体产生相应抗体。当用单个抗原检测其抗体水平反映牛结核感染状况时，灵敏度较低。经过大量研究证实“鸡尾酒”试验比任何单一抗原都要强，而且随着抗原数量的增多而增强。但“鸡尾酒”诊断方法中多种蛋白抗原生产费时费力，使用时配比不均，难于进行标准化生产等问题也已凸显出来，鉴于以上原因，本研究之一是对四种牛分枝杆菌抗原蛋白(MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6)进行了融合表达，旨在为牛结核病临床诊断提供一种敏感、特异的诊断抗原。胶体金免疫层析技术(Gold-Immunochromatographic Assay GICA)是近20年发展起来的一项免疫学检测技术。该技术不仅特异性强、敏感性高，而且不需昂贵仪器设备，操作简单快速。MPB83和MPB70已被证明是牛分枝杆菌主要的特异性分泌抗原。MPB70和MPB83蛋白的氨基酸序列具有63％的同源性，单克隆抗体验证了二者具有某些共同抗原决定簇。本研究利用牛分枝杆菌的两个同源蛋白质MPB70和MPB83，建立了一种双抗原夹心胶体金免疫层析法。旨在为牛结核病的临床诊断提供一种敏感、特异、快速、实用的新型诊断方法。主要研究内容包括：1．牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析克隆了牛分枝杆菌特异性抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的编码基因，构建原核表达载体，诱导表达蛋白，提纯融合蛋白质，并对其特性及其在牛结核病血清学诊断中的价值进行了初步评估。经ELISA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白MPB70、MPB83和CE(cfp10-esat6)的多抗反应，说明该融合蛋白具有四个抗原蛋白的免疫学活性。Western blot分析显示：该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应，而与牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白具有与单个蛋白相同的热稳定性。结果显示，融合蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性，作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。2．牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立利用胶体金免疫层析技术原理，用原核诱导表达的牛分枝杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原，制备牛结核抗体检测试纸条。结果粒径为40nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高;胶体金最佳标记pH值为6.0;MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5μg;MPB70抗原的最适包被浓度为3.0mg／mL;抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5mg／mL;交叉试验证明试纸条不与牛的其它非相关疾病的阳性血清反应，具有较高的特异性。比较实验证明其敏感性显著高于进口试纸条。3．牛结核病抗体胶体金快速检测技术的临床应用应用牛结核病抗体胶体金快速检测方法制备的胶体金试纸条进行临床样品检测，并与牛结核分枝杆菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较。本试纸条与牛分枝杆菌分离培养的符合率为85％，与TST的符合率为79.73％，与韩国试纸条的符合

关键词：牛分枝杆菌牛结核病特异性抗原胶体金免疫层析

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中华鲟脑膜败血伊丽莎白菌的分离鉴定及药敏特性

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水产学报 2018年第1期42卷 120-130页

作者：邸军张书环黄君杜浩周勇危起伟西南大学生命科学学院中国水产科学研究院长江水产研究所农业部淡水生物多样性保护重点实验室

为了确定中华鲟养殖基地一尾死亡子二代中华鲟的病原,利用传统病原菌分离方法,从濒死的中华鲟肝脏、脾脏和腹水中均分离到一株优势菌EM,采用16S r DNA基因序列分析、构建系统发育树并结合Biolog微生物自动分析系统进行鉴定,确定菌株EM... 详细信息

为了确定中华鲟养殖基地一尾死亡子二代中华鲟的病原,利用传统病原菌分离方法,从濒死的中华鲟肝脏、脾脏和腹水中均分离到一株优势菌EM,采用16S r DNA基因序列分析、构建系统发育树并结合Biolog微生物自动分析系统进行鉴定,确定菌株EM为脑膜败血伊丽莎白菌。进一步对健康子二代达氏鲟进行人工感染试验确定其致病性;同时通过观察患病子二代中华鲟组织切片分析其病理特征;并对菌株EM进行药敏特性研究以期指导临床用药。结果显示,被感染子二代中华鲟肝脏、脾脏及肾脏组织中铁血黄素沉积、实质性细胞空泡变性,溶血严重。菌株EM人工感染健康子二代达氏鲟,发现其对达氏鲟具有致病性,且从人工感染患病的达氏鲟肝脏中再次分离到相同的病原菌。药物敏感性试验表明,中华鲟脑膜败血伊丽莎白菌对米诺环素、克林霉素、克拉霉素和麦迪霉素4种药物敏感,对四环素、头孢噻肟和头孢西叮3种药物中度敏感,对其余28种药物不敏感,呈多重耐药性。本研究首次发现脑膜败血伊丽莎白菌可感染中华鲟,并对达氏鲟也具有致病性,并初步研究了病原菌的生物学特性、病理特征和药物敏感性,以期为该病的诊断和防治提供理论依据。

关键词：中华鲟脑膜败血伊丽莎白菌分离鉴定药敏试验病理特征

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中华鲟IFNc的克隆鉴定及表达模式研究

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海洋渔业 2024年

作者：丁广义郑楚文张书环杜浩许巧情危起伟农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室长江水产研究所长江大学中华鲟病害研究所贵州中医药大学鲟鱼健康养殖与药用价值研究中心

从中华鲟（Acipenser sinensis）转录组数据库中筛选和验证干扰素c（Interferon c，IFNc）基因，对中华鲟IFNc基因序列进行生物信息学分析，利用qPCR研究中华鲟IFNc基因在组织中和免疫刺激条件下的表达模式。结果表明，中华鲟IFNc基因OR... 详细信息

从中华鲟（Acipenser sinensis）转录组数据库中筛选和验证干扰素c（Interferon c，IFNc）基因，对中华鲟IFNc基因序列进行生物信息学分析，利用qPCR研究中华鲟IFNc基因在组织中和免疫刺激条件下的表达模式。结果表明，中华鲟IFNc基因ORF序列长549 bp，编码183个氨基酸，与斑点雀鳝（Lepisosteus oculatus）IFNc1一致性为32.13%；qPCR结果显示，中华鲟IFNc基因在各组织中呈低水平表达，在肌肉、血液、皮肤和体肾中表达量最高；中华鲟IFN-γ重组蛋白和Poly I:C诱导中华鲟肾细胞后，IFNc基因、抗粘液病毒基因（myxovirus resistance，Mx）和Viperin基因在24 h内呈显著上调。克隆鉴定了中华鲟IFNc，探究了其在免疫刺激条件下的表达规律，为中华鲟干扰素功能研究和抗病毒药物开发提供理论基础。

关键词：中华鲟 IFNc 抗病毒免疫调控

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长江江苏溆浦段2015年发现中华鲟野生幼鱼的形态和分子鉴定

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中国水产科学 2016年第1期23卷 1-9页

作者：张书环杨焕超辛苗苗吴金明戴振国杜浩刘志刚危起伟中国水产科学研究院长江水产研究所农业部淡水生物多样性保护重点实验室常熟市渔政管理站

在葛洲坝下中华鲟（Acipenser sinensis）产卵场连续两年未监测到自然繁殖的情况下,2015年6月在江苏溆浦段发现15尾疑似中华鲟幼鱼。本研究通过形态学和分子生物学方法对该15尾幼鲟进行鉴定。形态学度量结果显示,除1尾个体外,新发现的1... 详细信息

在葛洲坝下中华鲟（Acipenser sinensis）产卵场连续两年未监测到自然繁殖的情况下,2015年6月在江苏溆浦段发现15尾疑似中华鲟幼鱼。本研究通过形态学和分子生物学方法对该15尾幼鲟进行鉴定。形态学度量结果显示,除1尾个体外,新发现的14尾幼鲟与历史记载的中华鲟野生幼鱼生物学性状完全一致,但其体长和体重低于历史同期出现在该区域的中华鲟。同时采用11个多态微卫星位点,对15尾幼鲟样本和分布于我国的3种鲟鱼,包括30尾中华鲟（***）、39尾达氏鲟（***）和33尾施氏鲟（***）进行遗传分析,发现这15尾幼鲟与中华鲟的遗传距离最近(F;=0.039,P<0.05),其次为达氏鲟(F;=0.108,P<0.05),最远为施氏鲟(F;=0.209,P<0.05),从遗传和进化的角度判定该批幼鱼为中华鲟,该结果暗示中华鲟在葛洲坝下游极有可能找到了新的产卵场,为中华鲟的繁殖群体和幼鱼的种群监测提供了依据。遗传多样性分析显示,该批鱼的遗传多样性（SW=1.998）略低于野生中华鲟（SW=1.886）,暗示中华鲟幼鱼遗传多样性水平降低,野生亲本的数量仍不容乐观。

关键词：中华鲟种间鉴定微卫星产卵场长江口

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中华鲟免疫器官的早期发育

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中国水产科学 2019年第6期26卷 1096-1104页

作者：万玉芳邸军田波杜浩冷小茜张书环危起伟西南大学生命科学学院中国水产科学研究院长江水产研究所农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室长江大学动物科学学院

为了解中华鲟(Acipensersinensis)免疫器官早期发育的形态和组织学特征,实验以1～300dph中华鲟子二代的仔鱼、稚鱼和幼鱼为研究对象,使用连续石蜡切片技术和显微观察方法对免疫器官(头肾、胸腺和脾脏)的发育过程进行观察和记录。结果显... 详细信息

为了解中华鲟(Acipensersinensis)免疫器官早期发育的形态和组织学特征,实验以1～300dph中华鲟子二代的仔鱼、稚鱼和幼鱼为研究对象,使用连续石蜡切片技术和显微观察方法对免疫器官(头肾、胸腺和脾脏)的发育过程进行观察和记录。结果显示,培育水温为12.9～22.6℃时,中华鲟免疫器官原基出现的先后顺序为头肾(3dph)、胸腺(7dph)和脾脏(9dph);免疫器官淋巴化先后顺序为胸腺(12dph)、头肾(15dph)和脾脏(33dph)。仔鱼发育至15 dph可见头肾和胸腺间有淋巴细胞"桥"连接现象,180dph胸腺内可见哈氏小体结构,头肾、胸腺和脾脏内含有黑色素细胞或黑色素巨噬细胞中心(MMCs)。总体而言,中华鲟免疫器官发育具有原基出现时间早、发育速度慢和发育周期长的特点。由于仔稚幼鱼免疫系统发育不完善,建议在其培育过程中加强病害防治和早期疫苗的开发。

关键词：中华鲟免疫器官头肾胸腺脾脏

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中华鲟硬组织微结构及微化学的特征探索

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水产学报 2021年第3期45卷 424-432页

作者：姜涛王成友杜浩张书环刘洪波危起伟杨健中国水产科学研究院淡水渔业研究中心中国水产科学研究院长江水产研究所

为了在中华鲟洄游生态学研究上有新突破,实验首次比较研究了中华鲟3种硬组织(耳石、背骨板和胸鳍条)的微结构和微化学特征。结果发现,耳石结构松散,存在多个耳砂(微晶球霰石球晶)颗粒,且每个颗粒均具有独立的核心;背骨板存在分层现象;... 详细信息

为了在中华鲟洄游生态学研究上有新突破,实验首次比较研究了中华鲟3种硬组织(耳石、背骨板和胸鳍条)的微结构和微化学特征。结果发现,耳石结构松散,存在多个耳砂(微晶球霰石球晶)颗粒,且每个颗粒均具有独立的核心;背骨板存在分层现象;胸鳍条结构较为致密,且均一。胸鳍条、耳石中生境元素Co/Ca、Sr/Ca和Ba/Ca比特征变化较为一致,而背板由于分层的原因与前二者有所差异。综合考虑非致死性采样、前处理难度、微结构组成以及生境元素生物积累等优势,笔者建议首选胸鳍条作为基于微化学分析来反演中华鲟洄游及生活史履历研究的最佳硬组织材料。

关键词：中华鲟耳石背骨板胸鳍条微结构微化学

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中华鲟IFNe2的抗病毒天然免疫作用

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水产学报 2024年第5期48卷 46-55页

作者：李由申丁广义张书环郭慧芝周江罗凯许巧情长江大学中华鲟病害研究所贵州中医药大学鲟鱼健康养殖与药用价值研究中心

为探究中华鲟干扰素e2 (AsIFNe2)的免疫调控作用，本实验通过原核表达获得了重组中华鲟干扰素e2蛋白(rAsIFNe2)，并分析其对抗病毒相关基因的影响及其抗病毒活性。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)结果显示，rAsIFNe2能显著激活中华鲟鳍细胞... 详细信息

为探究中华鲟干扰素e2 (AsIFNe2)的免疫调控作用，本实验通过原核表达获得了重组中华鲟干扰素e2蛋白(rAsIFNe2)，并分析其对抗病毒相关基因的影响及其抗病毒活性。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)结果显示，rAsIFNe2能显著激活中华鲟鳍细胞中干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs)的表达，如Mx、 PKR、 Viperin和ADAR4。此外，rAsIFNe2还能通过激活IRFs和IFNes基因的表达，从而帮助宿主细胞迅速建立抗病毒状态。在鲤春病毒血症病毒(SVCV)感染鲤上皮细胞(EPC)模型中，rAsIFNe2能够诱导EPC细胞中Mx、PKR和Viperin的表达，并降低EPC细胞中SVCV病毒G、N和P基因的表达，减少病变效应的产生。研究表明，AsIFNe2在宿主抗病毒天然免疫反应中发挥作用。本研究为深入了解中华鲟的干扰素免疫系统以及治疗病毒性疾病提供理论依据。

关键词：中华鲟干扰素抗病毒鲤春病毒血症病毒免疫调控

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三角帆蚌微卫星富集文库的构建、鉴定及多态性分析

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中国水产科学 2010年第6期17卷 1200-1207页

作者：许巧情谢骏张书环赵朝阳袁汉文中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室长江大学动物科学学院中国科学院水生生物研究所

通过磁珠富集法构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)微卫星富集文库。共获得800个阳性克隆,其中的100个阳性克隆经测序分析,共获得微卫星序列54个。利用这些微卫星序列可设计33对引物,经过PCR扩增筛选获得了25对可用引物。利用聚丙烯酰... 详细信息

通过磁珠富集法构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)微卫星富集文库。共获得800个阳性克隆,其中的100个阳性克隆经测序分析,共获得微卫星序列54个。利用这些微卫星序列可设计33对引物,经过PCR扩增筛选获得了25对可用引物。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳,对洞庭湖1个种群的30只三角帆蚌进行扩增,发现13对引物呈现多态性,等位基因数在4～9。观测杂合度在0.2543～0.9827,期望杂合度在0.3629～0.8217,信息多态含量平均为0.5198。由于存在无效等位基因,两个微卫星基因座(GenBank登录号为GQ302651和GQ302658)明显地偏离哈代-温伯格平衡,但没有发现连锁不平衡现象。这说明利用磁珠富集法构建的三角帆蚌微卫星文库质量较好,13对多态性微卫星引物可为三角帆蚌微卫星连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究、分子标记辅助育种以及经济性状的QTL定位提供帮助。

关键词：三角帆蚌微卫星富集文库 PCR扩增多态性

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大鲵资源现状与保护建议

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淡水渔业 2013年第B07期43卷 13-17页

作者：梁志强张书环王崇瑞危起伟伍远安农业部淡水生物多样性保护重点实验室中国水产科学研究院长江水产研究所武汉430223 西南大学生命科学学院重庆400715 湖南省水产科学研究所长沙410153

大鲵（Andriasdavidianus）为我国特有两栖动物，国家二级重点保护动物。大鲵自然地理分布以我国大陆第二阶梯为主，秦巴山脉与武陵山脉为多。我国政府对大鲵保护高度重视，已建立53个涉及到大鲵保护的自然保护区，然而大鲵自然种群衰... 详细信息

大鲵（Andriasdavidianus）为我国特有两栖动物，国家二级重点保护动物。大鲵自然地理分布以我国大陆第二阶梯为主，秦巴山脉与武陵山脉为多。我国政府对大鲵保护高度重视，已建立53个涉及到大鲵保护的自然保护区，然而大鲵自然种群衰退明显。根据现场抽样调查并结合文献，估算目前我国大鲵自然资源量仅约为7．50万尾，与庞大的人工养殖群体数量形成鲜明对比，大鲵自然种群及其栖息地的有效保护迫在眉睫。建议在加强自然保护的同时，采取“哪里来放回哪里”的原则，在科学规划和论证的基础上，适度开展大鲵人工增殖放流，加强对放流群体的标志与跟踪监测，加强大鲵遗传研究，建立大鲵DNA信息库，以使大鲵自然种群得以逐步恢复、大鲵养殖产业得以可持续。

关键词：大鲵(Andrias davidianus) 自然资源现状保护建议

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从连续到偶发:中华鲟在葛洲坝下发生小规模自然繁殖

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中国水产科学 2017年第3期24卷 425-431页

作者：吴金明王成友张书环张辉杜浩刘志刚危起伟中国水产科学研究院长江水产研究所农业部淡水生物多样性保护重点实验室

中华鲟(Acipenser sinensis Gray)为国家一级重点保护野生动物,典型的溯河洄游产卵鱼类。历史上,中华鲟在长江上游及金沙江下游产卵,由于葛洲坝修建阻隔了其洄游通道,1981年以后在葛洲坝下形成了比较稳定的产卵场,1982―2013年,每年均... 详细信息

中华鲟(Acipenser sinensis Gray)为国家一级重点保护野生动物,典型的溯河洄游产卵鱼类。历史上,中华鲟在长江上游及金沙江下游产卵,由于葛洲坝修建阻隔了其洄游通道,1981年以后在葛洲坝下形成了比较稳定的产卵场,1982―2013年,每年均有自然繁殖发生。由于其栖息生境退化,每年洄游进入长江的中华鲟繁殖亲本逐年减少,2013―2015年连续3年在已知葛洲坝下中华鲟产卵场未监测到中华鲟自然繁殖活动。2016年11―12月的野外监测发现,中华鲟在宜昌葛洲坝下已知产卵场发生了自然繁殖。其中底层网具采集到中华鲟鱼卵(卵膜)67粒、仔鱼22尾;解剖食卵鱼发现,10尾食卵鱼类共摄食中华鲟卵454粒;水下视频观测到5处中华鲟卵黏附底质位点。根据采集到的鱼卵发育期及采集位点推算,产卵时间为2016年11月24日凌晨,产卵场位于葛洲坝大江电厂以下约300 m的江段内,产卵日水温为19.7℃,流量为6610 m3/s,水位为39.7 m。

关键词：中华鲟洄游自然繁殖葛洲坝产卵场

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