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产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及发酵培养基优化

中国酿造 2019年第10期38卷 84-88页

作者：贺秋红巩志金颜梅曲阜师范大学生命科学学院

该研究从自然界筛选出一株脂肪酶产生菌株,鉴定其种属并对其发酵培养条件进行研究。采集富油水样,利用罗丹明B培养基进行初筛,结合形态观察、生理生化试验和16S r DNA序列分析进行菌种鉴定,建立系统发育树。结果表明,筛选出一株产脂肪... 详细信息

该研究从自然界筛选出一株脂肪酶产生菌株,鉴定其种属并对其发酵培养条件进行研究。采集富油水样,利用罗丹明B培养基进行初筛,结合形态观察、生理生化试验和16S r DNA序列分析进行菌种鉴定,建立系统发育树。结果表明,筛选出一株产脂肪酶的细菌U5,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。通过单因素试验和响应面试验设计对发酵培养基中三丁酸甘油酯、葡萄糖、尿素添加量进行发酵优化。结果表明,最佳的发酵培养基组分为:三丁酸甘油酯2.0%(V/V),葡萄糖9 g/L,尿素8 g/L。在此优化条件下,粗脂肪酶酶活为4.3 U/m L,比优化前的酶活提高了16.22%。

关键词：脂肪酶菌株筛选枯草芽孢杆菌发酵培养基优化

辅因子NADPH调控对D-1,2,4-丁三醇合成的影响

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现代化工 2021年第S1期41卷 139-142页

作者：谷松鹤王金宝巩志金杨革高海军曲阜师范大学生命科学学院山东曲阜273100 北京理工大学生命学院北京100081

通过敲除编码6-葡萄糖磷酸脱氢酶基因zwf和编码磷酸葡萄糖异构酶基因pgi,对合成D-1,2,4-丁三醇(BT)的重组大肠杆菌胞内辅因子NADPH再生进行扰动,考察NADPH/NADP^(+)对BT合成的影响。结果显示,pgi基因缺失菌株MJ135kpG胞内NADPH/NADP^(+... 详细信息

通过敲除编码6-葡萄糖磷酸脱氢酶基因zwf和编码磷酸葡萄糖异构酶基因pgi,对合成D-1,2,4-丁三醇(BT)的重组大肠杆菌胞内辅因子NADPH再生进行扰动,考察NADPH/NADP^(+)对BT合成的影响。结果显示,pgi基因缺失菌株MJ135kpG胞内NADPH/NADP^(+)增加了25%,培养基中合理添加葡萄糖可以增强胞内NADPH供应,促进BT合成。当初始葡萄糖浓度为2 g/L时,24 h时再补加葡萄糖4 g/L可以进一步提高BT产量至4.13 g/L。

关键词： D-1,2,4-丁三醇 NADPH 重组大肠杆菌基因敲除

一株海洋链霉菌发酵条件的优化及其抑菌活性物质的研究

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中国酿造 2018年第12期37卷 101-105页

作者：梁光杰车程川巩志金杨革曲阜师范大学生命科学学院山东曲阜273165

灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)F8分离于黄海海岸线沉淀物,通过单因素试验优化其发酵条件,并对其代谢产物及抑菌活性进行研究。结果表明,最佳发酵条件为培养时间11 d、接种量8%、培养温度30℃、初始pH值8.0。菌株F8所产抑菌... 详细信息

灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)F8分离于黄海海岸线沉淀物,通过单因素试验优化其发酵条件,并对其代谢产物及抑菌活性进行研究。结果表明,最佳发酵条件为培养时间11 d、接种量8%、培养温度30℃、初始pH值8.0。菌株F8所产抑菌物质对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),变形杆菌(Proteus)和产气杆菌(Aerobacter aerogenes)具有抑制作用,抑菌圈直径分别为23 mm、34 mm、44 mm,最小抑菌浓度(MIC)分别为100μg/m L、30μg/m L、20μg/m L。菌株F8所产抑菌活性物质的酸碱、热、光照以及遗传稳定性均较好。

关键词：海洋链霉菌发酵条件优化抑菌物质性质最小抑菌浓度

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响应面法优化海藻寡糖的酶法提取工艺

中国酿造 2019年第11期38卷 59-62页

作者：贺秋红巩志金颜梅李桂芝曲阜师范大学生命科学学院山东曲阜273100 农业部海藻类肥料重点实验室山东青岛266000

该研究通过单因素试验和响应面试验设计对酶解海藻酸钠制备海藻寡糖的底物浓度、酶解温度及酶解pH值进行优化。结果表明,最佳酶解条件为海藻酸钠质量浓度1.0 g/100 mL、酶解温度40℃、酶解pH值8.0。在此最佳酶解条件下,海藻寡糖的平均... 详细信息

该研究通过单因素试验和响应面试验设计对酶解海藻酸钠制备海藻寡糖的底物浓度、酶解温度及酶解pH值进行优化。结果表明,最佳酶解条件为海藻酸钠质量浓度1.0 g/100 mL、酶解温度40℃、酶解pH值8.0。在此最佳酶解条件下,海藻寡糖的平均聚合度为4.08,比优化前降低了27.35%。

关键词：海藻酸钠海藻胶裂解酶海藻寡糖响应面优化

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拮抗黄曲霉海洋放线菌的筛选及发酵条件优化

中国酿造 2019年第3期38卷 104-109页

作者：曹利车程川刘金锋巩志金梁光杰杨革曲阜师范大学生命科学学院山东曲阜273165

该研究从黄海海域沉积物中筛选一株能高效抑制黄曲霉(Aspergillus flavus)的海洋放线菌,通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行鉴定,并以抑菌圈直径为响应值,通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验及响应面试验对其产抑... 详细信息

该研究从黄海海域沉积物中筛选一株能高效抑制黄曲霉(Aspergillus flavus)的海洋放线菌,通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行鉴定,并以抑菌圈直径为响应值,通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验及响应面试验对其产抑菌活性物质的发酵条件进行优化。结果表明,筛选获得一株对黄曲霉抑制活性较高的菌株B11,并鉴定其为锈赤蜡黄链霉菌(Streptomyces rubiginosohelvolus);菌株B11产抑菌活性物质的主要影响因素为发酵温度、发酵时间及接种量,最优发酵条件为:发酵温度29℃、发酵时间11d、接种量5%。在此最优发酵条件下,抑菌圈直径达到(2.9±0.15)cm,抑菌圈直径比优化前(1.4±0.15)cm增大51.72%。

关键词：海洋放线菌黄曲霉筛选及鉴定抑菌活性发酵条件优化

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Cu,Zn-SOD的理性设计及稳定性研究

Cu,Zn-SOD的理性设计及稳定性研究

铜绿假单胞菌发酵产鼠李糖脂生物表面活性剂的方式及条件研究

中国生物工程学会第十一届学术年会暨2017年全国生物技...

作者：刘金锋巩志金车程川杨革曲阜师范大学生命科学学院

SOD是超氧阴离子自由基(O)的专一性清除剂,能够预防和治疗超氧阴离子引起的多种疾病如风湿性关节炎、肺气肿、老年性白内障等。目前,SOD除了药用外已被添加至多种食品和化妆品中来作为保健品及延缓衰老。因此,SOD是很有前途的一种蛋白酶... 详细信息

SOD是超氧阴离子自由基(O)的专一性清除剂,能够预防和治疗超氧阴离子引起的多种疾病如风湿性关节炎、肺气肿、老年性白内障等。目前,SOD除了药用外已被添加至多种食品和化妆品中来作为保健品及延缓衰老。因此,SOD是很有前途的一种蛋白酶,有着非常广泛的应用前景。但是由于天然SOD在体内具有许多缺点如:停滞期短、不稳定、免疫原性、易于被蛋白酶水解等,从而影响得到大规模生产及广泛的应用。因此,为了克服上述缺陷,设计开发出活性高、稳定性强的新型SOD就非常必要。本研究主要是通过PDB(Protein Data Bank)数据库得到小鼠的Cu,Zn-SOD三维晶体构象,使用Discovery Studio 4.0蛋白设计软件对Cu,Zn-SOD蛋白质的非保守区序列进行基于热稳定性的虚拟氨基酸突变和分子动力学模拟,根据折叠自由能的差值△△Gmut变化确突变氨基酸位点组合,并通过分子动力学模拟得到最后的突变氨基酸位点。然后通过实验构建野生型和突变型的重组表达质粒并转入大肠菌DH5α和BL21中进行克隆和表达,对表达得到的Cu,Zn-SOD及MCu,Zn-SOD的热稳定性进行验证。本研究的主要过程及结果如下:1.自NCBI获得来自猩猩、牛、羊、人等的Cu,Zn-SOD的氨基酸序列,将以上氨基酸序列与Mus Musculus的序列通过软件ClustalX2进行氨基酸序列的比对,并由DNAman分析得到小鼠Cu,Zn-SOD的保守序列,将相对应的27个非保守氨基酸序列作为待突变的位点;2.通过PDB数据库获得Mus Musculus的Cu,Zn-SOD分子晶体结构(登录号:3GTT)并载入软件Discovery Studio 4.0中,采用虚拟氨基酸定点突变技术,将Cu,Zn-SOD中待突变的非保守氨基酸分别突变为其他的19种氨基酸,根据能量变化最终得到单点突变(S-MSOD)、双点突变(D-MSOD)和三点突变(T-MSOD)的突变能变化最优的TOP5突变体;3.通过对WT-SOD、S-MSOD、D-MSOD和T-MSOD的突变能突变能变化最优的TOP5;突变体进行10 ns分子动力学模拟,由Analysis Trajectory模块进行分析得到RMSD、RMSF、Potential Energy、Bond Energy等数据,从中确定最优的单点突变为:Q49W;双点突变为:Q49W/G90I;三点突变为:V30W/Q49W/G90I;4.从小鼠血液中提取RNA,并通过PCR、Over-lap PCR、酶切、连接、转化等步骤构建重组质粒p GEX6p-1-SOD、p GEX6p-1-S-MSOD、pGEX6p-1-D-MSOD、pGEX6p-1-T-MSOD;5.将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,反复冻融法破菌后对全菌液、上清及沉淀进行SDS-PAGE电泳,确定Cu,Zn-SOD上清中在16 kD左右处产生特异性蛋白条带,说明Cu,Zn-SOD有适量可溶性表达。以GST琼脂糖为介质利用亲和层析法纯化得到野生型融合蛋白GST-SOD及突变型融合蛋白GST-MSOD。Thrombin凝血酶对融合蛋白切割得到SOD和MSOD纯品;6.25℃,邻苯三酚自氧化法测定野生型SOD及突变型SOD比活。比活测定结果为:WT-SOD比活为714 U/mg;S-MSOD比活为839 U/mg;D-MSOD比活为632 U/mg;T-MSOD比活868 U/mg。S-MSOD比WT-SOD酶活提高17.5%;T-MSOD比WT-SOD酶活提高21.6%;D-MSOD较WT-SOD酶活降低13%;7. WT-SOD和MSOD稳定性测定:当在85℃温度条件下处理1 h,WT-SOD的相对酶活;剩余为10%左右;T-MSOD蛋白的稳定性较WT-SOD有明显提高,其相对酶活剩余为35%左右;而D-MSOD则较WT-SOD稳定性有一定的降低,其相对酶活剩余为7%左右;S-MSOD较WT-SOD稳定性也有明显的提高,其相对酶活剩余为20%左右。

关键词：超氧化物歧化酶理性设计氨基酸虚拟突变分子动力学模拟酶活稳定性

来源： cnki会议评论

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中国酿造 2017年第10期36卷 130-134页

作者：巩志金车程川杨革刘金锋梁光杰梁鑫鑫刘胜格曲阜师范大学生命科学学院山东曲阜273165

该文综述了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生成鼠李糖脂的相关发酵技术的研究概况,包括液态发酵、半固态发酵和固态发酵等。重点介绍了影响液态发酵的相关因素,如碳源、氮源、无机盐、温度、pH、消泡方法及分批补料发酵等的研究... 详细信息

该文综述了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生成鼠李糖脂的相关发酵技术的研究概况,包括液态发酵、半固态发酵和固态发酵等。重点介绍了影响液态发酵的相关因素,如碳源、氮源、无机盐、温度、pH、消泡方法及分批补料发酵等的研究现状,以期为今后利用铜绿假单胞菌发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂提供研究思路和技术参考。

关键词：铜绿假单胞菌鼠李糖脂发酵生物表面活性剂

日照海岸线可培养放线菌的抑菌活性及其多样性研究

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中国酿造 2019年第1期38卷 118-124页

作者：梁光杰车程川曹利巩志金刘金锋姜曰水孙萍刘宝晴杨革曲阜师范大学生命科学学院山东曲阜273165

本研究采用不同的筛选培养基及预处理方法对中国日照海岸线放线菌的分布、抗菌活性和多样性进行研究。结果表明,从中国日照海岸线样品中共分离到208株放线菌,其中91株放线菌具有抑菌作用,35株对产气杆菌有抑制作用,25株对变形杆菌有抑... 详细信息

本研究采用不同的筛选培养基及预处理方法对中国日照海岸线放线菌的分布、抗菌活性和多样性进行研究。结果表明,从中国日照海岸线样品中共分离到208株放线菌,其中91株放线菌具有抑菌作用,35株对产气杆菌有抑制作用,25株对变形杆菌有抑制作用,17株对金黄色葡萄球菌有抑制作用,9株对大肠杆菌有抑制作用,2株对铜绿假单胞菌有抑制作用,3株对黄曲霉有抑制作用。经分子生物学鉴定,25株抗菌活性较好的代表菌株可以分为22个种,3个不同的属:链霉菌属(Streptomyces sp.)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis sp.)、糖单孢菌属(Saccharomonospora sp.),其中链霉菌属是优势菌属。

关键词：可培养放线菌日照海岸线抑菌活性多样性

响应面法优化铜绿假单胞菌产鼠李糖脂发酵培养基的研究

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中国酿造 2017年第9期36卷 127-131页

作者：巩志金刘胜格梁鑫鑫魏贝贝梁光杰杨革刘金锋车程川曲阜师范大学生命科学学院山东曲阜273100

该研究对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SKY01产鼠李糖脂的发酵培养基组分进行了优化。采用单因素试验确定豆油、硝酸钠及微量元素的添加量。在单因素试验的基础上,采用响应面试验设计进行培养基组分优化。结果表明,最佳发酵培... 详细信息

该研究对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SKY01产鼠李糖脂的发酵培养基组分进行了优化。采用单因素试验确定豆油、硝酸钠及微量元素的添加量。在单因素试验的基础上,采用响应面试验设计进行培养基组分优化。结果表明,最佳发酵培养基配方为豆油80 g/L、硝酸钠4 g/L、微量元素8.5‰。在此最佳培养基组分条件下,鼠李糖脂的产量达到45.34 g/L,比优化前的产量39.62 g/L提高了14.43%。

关键词：铜绿假单胞菌鼠李糖脂响应面法培养基组分优化