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缺失型α-地中海贫血基因拷贝数定量检测试剂盒的研制

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缺失型α-地中海贫血基因拷贝数定量检测试剂盒的研制

作者：王格南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景与目的地中海贫血(thalassemia,简称地贫)是由于珠蛋白基因发生缺陷;致使珠蛋白链合成减少或缺如,使形成血红蛋白的α-链/非α-链比例失衡,而导致的一组严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病,主要发生在地中海沿岸国家... 详细信息

研究背景与目的地中海贫血(thalassemia,简称地贫)是由于珠蛋白基因发生缺陷;致使珠蛋白链合成减少或缺如,使形成血红蛋白的α-链/非α-链比例失衡,而导致的一组严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病,主要发生在地中海沿岸国家、东南亚、非洲和我国南方地区,保守估计全世界地中海贫血基因携带者近2亿人,其中包括我国南方广西、广东、海南等省份。地中海贫血主要包括α-地中海贫血和p-地中海贫血,在广西、广东,α-地中海贫血基因的人群携带率分别高达17.55%、8.53%。此病目前缺乏有效治疗手段,应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。 α-地中海贫血属于常染色体隐性遗传病,其分子基础是位于16号染色体末端16p13.3位点上的人a珠蛋白基因簇的先天性遗传缺陷。导致α-链合成减少的基因缺陷主要(>95%)是α珠蛋白基因缺失,其缺失数目是a-地中海贫血临床表现及分型的依据。在我国南方地区常见的三种α-地中海贫血缺失基因型为--SEA/αα(东南亚型)、-α3,7/aa(右缺失型)、-α4.2/αα(左缺失型)。目前对于α-地中海贫血的筛查仅停留在血液学指标,即只有明显的血液学表型的个体才会进行进一步的分子诊断,这会导致大部分的静止型携带者(如-α3.7/αα和-α4.2/αα)漏检,所以对于α-地中海贫血的筛查急需一种简单、快速基因分型的筛查手段。然而对于α-地中海贫血的分子诊断,Southern Blot杂交技术是金标准,准确性高,但操作繁琐、标本用量大、费时费力、检测通量小而不适合常规检测;目前常规的检测技术是gap-PCR技术,只能定性检测各已知缺失类型,工作量大、检测通量小,并且存在其他缺失类型的假阴性和PCR污染导致的假阳性,故仍不能满足当前大规模人群筛查及常规分子诊断的需要。本课题组发明了一种用基因拷贝数直接定量快速诊断缺失型α-地中海贫血的方法(专利号：ZL201110081598.8),该方法是采用TaqMan实时定量荧光PCR技术直接定量分析HBZ、HBA1和HBA2的相对拷贝数来诊断是否存在缺失,有效避免了由缺失类型遗传异质性导致的假阴性和外源污染导致的假阳性,且易于实现自动化与标准化,提高了检测通量和检测效率,适合缺失型a-地中海贫血大规模人群筛查和常规分子诊断。本研究是以该发明专利为技术基础,通过全基因组DNA提取的研制和PCR扩增检测体系的建立,研制出可用于临床常规检测应用的试剂盒,以满足当前临床检测的需要。研究方案与方法一个分子诊断方法,涉及到样本来源、样本制备、样本检测、结果分析等步骤,只有做好每个步骤的质量控制,才能保证结果的准确可靠,所以,基于这种完整的诊断流程,本研究具体实施了以下研究方案与方法。 1.样本采集、运送及保存。不同的抗凝剂对PCR扩增的影响是不同的,例如肝素抗凝的血液标本经DNA提取后仍会影响PCR的扩增效率。血液的新鲜程度也会影响DNA提取的质量。故本研究所采用的血液标本均要求为EDTA或枸橼酸钠抗凝全血,存放在4℃冰箱不超过7天,在-20±5℃保存期为6个月;若要长期保存,需储存于-80±5℃;标本应避免反复冻融。 2.全血基因组DNA提取。人类基因组DNA样本的浓度和纯度对PCR扩增都具有较大的影响,例如人类基因组DNA样本浓度太低(低于最低检测限)或含有PCR抑制剂会导致PCR扩增受到影响。因此本研究从红细胞裂解液、变性剂、消化时间、提取液和DNA溶解液等方面对DNA提取方法进行全面的研制,研制出一种能满足荧光定量PCR要求的DNA提取方法,并利用紫外分光光度计来监测DNA样本的浓度和纯度。 3.试剂盒原料的质量检测。原料质量合格是一个实验成功的基本要求,所以原料的质量检测尤为重要。主要的原料包括蛋白酶K、氯化锂、引物、探针和聚合酶。蛋白酶K应为白色絮状或粉末状;氯化锂应为白色结晶粉末,分析纯;引物和探针应采用紫外分光光度计测定浓度,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定,浓度不低于合成的浓度,电泳结果应为位置正确的单一条带,表示纯度合格;聚合酶应为无色粘稠的透明液体,于-20±5℃不冻结。 4.试剂盒配制与验证。试剂盒主要包括全血基因组DNA提取试剂和PCR检测试剂。全血基因组DNA提取试剂包括红细胞裂解液、DNA提取液A(缓冲液)、DNA提取液B(变性剂)、DNA提取液C(蛋白酶)、DNA提取液D、DNA溶解液。PCR检测试剂包括PCR反应液A(缓冲液,酶)和PCR反应液B(引物,探针)。所有液体配制需按照配制要求进行,配制好的液体按照相应的要求灭菌后存放或者直接存放。将配制好的全血基因组DNA提取试剂(柱提法)结合质检合格的试剂盒其它组分,以正常基因型校准品1、2、阳性参考品P1、P6、P8和阴性质控品为样本,在适

关键词：缺失型α-地中海贫血基因拷贝数定量试剂盒研制实时定量PCR

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高端家具上演中西合璧 B03

北京商报

作者：王格

同样是一把椅子，中式的元亨利（左）与西式的华莎驰（右）风格相差很大，却同样属于高端产品，可以共享消费群体，这是元亨利在京为华莎驰开设超大旗舰店的合作基础。　　　　高端客户对装修风格多样化的需求，正驱使不同风格的高端家...

同样是一把椅子，中式的元亨利（左）与西式的华莎驰（右）风格相差很大，却同样属于高端产品，可以共享消费群体，这是元亨利在京为华莎驰开设超大旗舰店的合作基础。　　　　高端客户对装修风格多样化的需求，正驱使不同风格的高端家具品牌走向互融和联合。5月6日，一个面?

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糖尿病性骨关节病1例报告

福建医药杂志 1980年第6期 60-61页

作者：王格珍刘芳眉福州军区总医院福州军区总医院 172医院

病例介绍余××,女性,57岁,住院号31788。大约自1975年起,患者于走长路时,感左前足底轻度酸痛,但无局部肿胀及由此而致行走不便,故未引起注意。1978年10月发现左3、4脚趾变形,不能伸屈活动,到某院检查,拍片发现左蹠骨3～4骨干狭小,远端... 详细信息

病例介绍余××,女性,57岁,住院号31788。大约自1975年起,患者于走长路时,感左前足底轻度酸痛,但无局部肿胀及由此而致行走不便,故未引起注意。1978年10月发现左3、4脚趾变形,不能伸屈活动,到某院检查,拍片发现左蹠骨3～4骨干狭小,远端骨骺变窄小,并向内半脱位,相邻关节面消失,疑为“麻风病”。后在皮肤病院检查,未发现皮肤感觉减退及浅表神经肿大,皮肤活检未找到麻风杆菌,虽排除了麻风病,但诊断仍不明确。1979年4月3日以冠心病、心绞痛、糖尿病住入我科。既往除1972年发现血压增高外,无外伤、皮肤感染和末梢神经性疾病,否认性病史。体检,血压150/90mmHg,体胖,肺(-),

关键词：骨关节病糖尿病性骨端骨质半脱位不全脱位脊髓空洞局部关节

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试析庐山会议转向的原因

中国石油大学学报(社会科学版) 1997年第1期 54-56页

作者：王格芳,仝祥顺山东师范大学山东师范大学

500例新生儿体重、身长、头围与颅脑径线测量的统计

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内蒙古医学杂志 1983年第1期 8-11页

作者：霍述汉金玮王格泰内蒙古医学院附属医院儿科教研组内蒙古医学院生理教研组心理组内蒙古医学院附院理疗科超声诊断室

人类医学对脑的研究从宏观到微观,从形态到机能已有大量记载,如脑的形态、沟回、重量、大小、大脑皮层的平均厚度、面积、脑的神经细胞数,以及采用现代最先进的物理化学方法从各种水平对脑的结构与功能进行着大量的基本理论研究。目前... 详细信息

人类医学对脑的研究从宏观到微观,从形态到机能已有大量记载,如脑的形态、沟回、重量、大小、大脑皮层的平均厚度、面积、脑的神经细胞数,以及采用现代最先进的物理化学方法从各种水平对脑的结构与功能进行着大量的基本理论研究。目前在临床上对新生儿头颅的发育儿科仍以头围和身长与头长之比做为生理指标,其间也包括着脑的发育。

关键词：前后径左叶统计值径线头围新生儿体重身长颅脑

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试析庐山会议转向的原因

无人区电轴对房颤伴宽QRS波的鉴别诊断价值

中国现代史 1997年第5期 54-56页

作者：王格芳仝祥顺

1959年夏天召开的庐山会议，是我们党在纠正“大跃进”“左”倾错误过程中的一次重大曲折。这次会议从开始纠“左”到后来反右，来了个180度的转折，使原来的“左”倾错误发展到更严重的程度。庐山会议转向，是由多方面的因素合力作用...

1959年夏天召开的庐山会议，是我们党在纠正“大跃进”“左”倾错误过程中的一次重大曲折。这次会议从开始纠“左”到后来反右，来了个180度的转折，使原来的“左”倾错误发展到更严重的程度。庐山会议转向，是由多方面的因素合力作用的结果。一、党在指导思想上的“左”倾错误，是庐山会议转向的根本原因“大跃进”和人民公社化运动是毛泽东晚年带有浓厚空想色彩的社会主义建设思想的实践。但这场运动仅仅沸腾了半年，问题便接踵而来：国民经济各种比例失调，工业生产全面紧张，高指标、瞎指挥、浮夸风、共产风、强迫命令泛滥成灾，社会生产力遭到严重破坏。理想和现实的矛盾迫使毛泽东和中央领导头脑冷静下来，采取一系列措施纠正工作中的“左”倾错误，收到了一定效果。但是，由于历史条件的限制，从第一次郑州会议到庐山会议召开前，党对错误的性质、程度、范围认识得远远不够。认为“1958年我们的成绩和缺点的关系，正如我们所常说的只是九个指头和一个指头的关系。”把运动中出现的问题“看作是具体执行中的问题，而对‘大跃进’和人民公社本身没有任何怀疑，不认识也不承认指导思想上有什么失误。”这不仅使实际工作中的纠“左”不可能彻底，而且纠正实际工作中的问题是为了更好地贯彻中央的指导思想，坚持和发展“三面红旗”。因此，从全局来说，党的指导思想依然深陷在“左”的窠臼中。仍把社会主义建设总路线、“大跃进”、人民公社当成是中国社会主义建设的正确道路和独特创造，是不能动摇和不容怀疑的。庐山会议初期开“神仙会”，是迫于形势，准备继续纠正一下“左”，但对纠正错误的进展估计过高，认为“解决这些问题只需要扫尾措施，不象4个月前在第二次郑州会议上那样，需要大动干戈”。会议开始时，毛泽东对“大跃进”以来党的工作和形势概括为三句话：“成绩伟大，问题不少，前途光明”。由此可见，毛主席认为：“大跃进”、人民公社是符合历史发展需要的。总之，当时毛主席和党中央对总路线、“大跃进”和人民公社的根本立场是赞成的、拥护的。因此，对总路线、“大跃进”和人民公社不用“言词偏激”，就是稍有微词，也就成了“对立面”，成了“右”倾了。彭德怀要从指导思想上、从根本上纠“左”。他虽然没有明确否定“三面红旗”，还正面肯定了“三面红旗”，但实际上动摇了“三面红旗”。他认为总路线本身还要发展完善，人民公社办早了，“大跃进”的速度太快了，这势必同党的“左”的指导思想发生冲突，必然为毛泽东所不能容忍，这就是庐山会议由纠“左”到反右的根本原因。

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来源：人大复印报刊资料评论

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临床心电学杂志 2010年第6期19卷 434-436页

作者：王格社王红艳陕西省咸阳市中心医院 712000

目的探讨无人区电轴与兔耳征对心房颤动(AF)伴宽QRS波的鉴别诊断价值。方法对65例AF合并宽QRS波者,经综合判断为AF合并室性期前收缩(PVS)40例,AF合并室内差异传导(差传)25例。经体表心电图I、aVF导联目测心电轴,根据V1导联QRS波形态判... 详细信息

目的探讨无人区电轴与兔耳征对心房颤动(AF)伴宽QRS波的鉴别诊断价值。方法对65例AF合并宽QRS波者,经综合判断为AF合并室性期前收缩(PVS)40例,AF合并室内差异传导(差传)25例。经体表心电图I、aVF导联目测心电轴,根据V1导联QRS波形态判断有无兔耳征。结果 65例中,11例存在无人区电轴者均发生于AF合并PVS,无一例出现于AF合并差传者。13例左兔耳征者亦均发生于AF合并PVS。两者诊断AF合并PVS的特异性均达100%。22例右兔耳征者中有15例为AF合并差传。结论无人区电轴及左兔耳征均可作为鉴别AF合并PVS或差传的指标,两者特异性均很高,具有重要的临床意义,但敏感性较低。

关键词：无人区电轴兔耳征心房颤动室性期前收缩室内差异传导

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