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Hfq蛋白在布鲁氏菌胞内生存中作用的研究

Hfq蛋白在布鲁氏菌胞内生存中作用的研究

作者：崔明全四川农业大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患传染病,能侵害多种家畜、野生动物、以及人类等,在世界各地广泛分布,对人类健康和经济发展构成严重威胁。布鲁氏菌是一种胞内寄生菌,无质粒和外毒素等毒力元件,胞内生存和复制是布鲁氏菌主要... 详细信息

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患传染病,能侵害多种家畜、野生动物、以及人类等,在世界各地广泛分布,对人类健康和经济发展构成严重威胁。布鲁氏菌是一种胞内寄生菌,无质粒和外毒素等毒力元件,胞内生存和复制是布鲁氏菌主要的毒力特征,而适应胞内环境又是布鲁氏菌实现胞内生存的关键。Hfq (host factor for RNA phage Qβ replicase)是一个高度保守的RNA结合蛋白,已测序的细菌中近一半存在Hfq蛋白。Hfq蛋白是一种转录调控因子,具有RNA伴侣分子的活性,能够与富含A/U的RNA序列紧密结合。Hfq主要生物学功能是通过结合RNA来影响其稳定性或者是通过辅助sRNA (small non-coding RNA)与mRNA结合来调节靶基因的表达。已有研究表明,Hfq蛋白是细菌中重要的转录后整体调控子,能同时调控大量靶标基因的表达,进而在包括致病在内的多个细胞过程中发挥整体调控作用。结合其它病原菌Hfq研究现状和布鲁氏菌的自身特点,我们推测布鲁氏菌Hfq蛋白可能通过影响靶基因的表达发挥重要调节功能,进而在布鲁氏菌适应胞内恶劣环境及胞内生存中发挥重要作用。因此,深入研究Hfq的功能以及寻找受Hfq调控的蛋白和基因,将有助于布鲁氏菌致病机制的研究。为了分析Hfq蛋白在布鲁氏菌胞内生存中的作用,并寻找Hfq调控的靶基因,我们首先构建了Hfq缺失突变株和互补株。基于同源重组的基因突变原理,以KmR(卡那抗性盒)替代了布鲁氏菌中的hfq基因,构建了布鲁氏菌的Hfq缺失突变株16MAhfq。随后,将hfq基因克隆至能够在布鲁氏菌内复制的pBBR1-MCS5载体上,构建了互补质粒,将该互补质粒转入到突变株中,得到相应的互补菌株16M△hfq-C。用半定量RT-PCR的方法对构建的突变株和互补株进行验证,结果表明突变株中没有hfq基因的转录活性,而互补株中hfq的转录活性得到恢复,表明突变株和互补株构建成功。Hfq缺失株和互补株的构建为布鲁氏菌Hfq的相关研究奠定了基础。成功构建了Hfq突变株和互补株以后,对野生株、Hfq突变株和互补株的相关表型进行了比较,分析Hfq的缺失对布鲁氏菌表型的影响,尤其是与胞内生存相关的表型。首先分析了Hfq对布鲁氏菌生长速度的影响,根据菌液的光密度(OD;optical density)值,绘制了16M、16M△hfq、16M△hfq-C的生长曲线。结果显示,与野生株16M相比,16M△hfq突变株的生长速度明显减慢,而互补株的生长速度和野生株一致。结果提示Hfq与布鲁氏菌的生长代谢有关。巨噬细胞内生存和繁殖是布鲁氏菌致病的关键,巨噬细胞内环境中包含多种杀(抑)菌物质,而布鲁氏菌必须适应这种环境才能在胞内生存和繁殖。因此,我们分析了16M△hfq突变株在模拟巨噬细胞内生存环境的多种体外胁迫条件下的生存能力,包括：高渗透压、氧压、低pH、热应激。实验结果表明：在各种体外刺激条件下,16M△hfq突变株的生存率均低于野生株,而互补株的生存率则与野生株接近。结果提示Hfq与布鲁氏菌适应环境压力相关,在适应胞内的恶劣环境中发挥一定作用。为了明确Hfq蛋白与布鲁氏菌的胞内生存和毒力的关系,我们又分析了16M△hfq突变株在巨噬细胞和小鼠体内的生存能力。实验结果表明,16M△hfq突变株虽然可以入侵巨噬细胞并在小鼠的脾脏细胞内生存,但生存能力明显减弱,提示Hfq对于布鲁氏菌在宿主细胞内的复制,长期生存以及建立慢性感染是必须的。该结果进一步证实了Hfq与布鲁氏菌的胞内生存和毒力密切相关。Hfq蛋白作为转录后调节因子,主要通过调节靶基因的表达来发挥整体调控作用。因此,我们第四章的工作是利用DNA芯片转录谱和比较蛋白质组分析,分别从全基因组和蛋白水平鉴定Hfq调控的靶基因,并对这些基因的功能进行阐述,为Hfq调控网络的研究提供靶标基因。首先,利用RT-PCR分析了物在模拟巨噬细胞内环境的体外不同刺激条件下的转录水平,确定了hfq体外高效表达的条件。结果显示,在酸性基础培养基(GEM4.0)中hfq转录水平最高。然后,我们利用布鲁氏菌的全基因组芯片,比较分析了16M△hfq突变株与16M野生株在hfq基因高表达条件下(GEM4.0)转录谱的差异。结果显示,当hfq基因缺失后,共有359个基因的转录变化在2倍以上,占羊布鲁氏菌16M全部编码基因的11%。这些差异表达的基因主要涉及物质转运和代谢,转录、翻译、膜功能、胞内运输及分泌等。此外,利用双向电泳-质谱的蛋白质组学研究方法比较了16M和16M△hfq在hfq基因高表达条件下全菌蛋白表达差异。结果表明,hfq基因缺失后,布鲁氏菌的蛋白表达也发生了明显的变化。这些差异表达的蛋白主要包括：转运和代谢相关蛋白、翻译后修饰和分子伴侣、外膜蛋白

关键词：羊种布鲁氏菌 Hfq 胞内生存毒力比较蛋白质组比较转录组

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对氨基苯酚合成用双功能催化剂的研制

石油化工 2004年第z1期33卷 910-912页

作者：武森涛储伟崔明全陈建钧四川大学化工学院四川成都610065 四川大学化工学院四川成都610065 四川大学化工学院四川成都610065 四川大学化工学院四川成都610065

以固体酸为载体,Pt为活性组分制备了双功能催化剂并应用于硝基苯加氢重排制备对氨基苯酚.结果表明,固体酸表面酸性的确可以促进中间体苯胲的重排,从而提高对氨基苯酚的选择性.吡啶红外谱图表明,B酸对选择性影响较大,而L酸对活性影响较大.

关键词：硝基苯加氢对氨基苯酚双功能催化剂负载杂多酸 HF处理分子筛吡啶红外

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家禽养殖企业应对减抗和控制兽药残留的措施

中国禽业导刊 2018年第12期35卷 13-14,16页

作者：崔明全中国兽医药品监察所

养殖企业要做好疾病诊断，保证诊断正确无误，根据药敏试验选择治疗药物，在用药时注重给药剂量、间隔时间和疗程，保留用药记录并严格遵守休药期；同时配以适宜的饲养方式、生物安全措施、酶制剂、免疫促进剂等替抗方案，以此减少抗生... 详细信息

养殖企业要做好疾病诊断，保证诊断正确无误，根据药敏试验选择治疗药物，在用药时注重给药剂量、间隔时间和疗程，保留用药记录并严格遵守休药期；同时配以适宜的饲养方式、生物安全措施、酶制剂、免疫促进剂等替抗方案，以此减少抗生素的使用。养殖企业可通过科学制定每日允许摄入量、最高残留限量标准和休药期来控制兽药残留。

关键词：养殖企业兽药残留控制每日允许摄入量家禽生物安全措施残留限量标准疾病诊断

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科学使用抗菌药物,保障动物源食品安全

兽医导刊 2018年第11期 14-15页

作者：崔明全中国兽医药品监察所

一、为什么要控制细菌耐药性？1.抗菌药物使用目的。（1）治疗患病动物;（2）预防群体动物暴露之后健康动物发病;（3）控制群体中疾病的蔓延;（4）促生长,通过抑制有害菌改善营养。2.控制抗菌药物的意义。控制抗菌药物使用能够减轻动物... 详细信息

一、为什么要控制细菌耐药性？1.抗菌药物使用目的。（1）治疗患病动物;（2）预防群体动物暴露之后健康动物发病;（3）控制群体中疾病的蔓延;（4）促生长,通过抑制有害菌改善营养。2.控制抗菌药物的意义。控制抗菌药物使用能够减轻动物可预防和治疗的疾病带来的病痛和死亡,健康动物是安全的食品供应的第一步,控制抗菌药物使用可以促进可持续发展,对经济意义重大。

关键词：动物源食品安全抗菌药物科学使用保障药物使用细菌耐药性可持续发展食品供应

全基因组测序技术对沙门氏菌血清型和耐药性的预测能力分析

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微生物学报 2021年第12期61卷 4038-4047页

作者：张璐沈青春张纯萍赵琪崔明全李霆程敏中国兽医药品监察所北京100081

【目的】评价全基因组测序技术在沙门氏菌血清型和耐药性检测方面的应用能力。【方法】对我国1950–2015年分离的290株鸡源沙门氏菌用常规检测方法进行了血清分型和药敏试验;提取全基因组进行测序,应用SeqSero和ResFinder数据库分析沙... 详细信息

【目的】评价全基因组测序技术在沙门氏菌血清型和耐药性检测方面的应用能力。【方法】对我国1950–2015年分离的290株鸡源沙门氏菌用常规检测方法进行了血清分型和药敏试验;提取全基因组进行测序,应用SeqSero和ResFinder数据库分析沙门氏菌的血清型和耐药性;对用常规检测方法和全基因组测序分析方法得到的血清型和耐药性结果进行比较,分析两种方法所得结果的符合性情况。【结果】沙门氏菌的主要血清型为肠炎和鸡白痢(≥84.5%),常规检测方法和全基因组测序分析方法在沙门氏菌血清分型方面的总体符合率为97.6%。对11种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)检测结果显示,沙门氏菌对磺胺异噁唑(39.3%)、氨苄西林(39.0%)和粘菌素(39.0%)的耐药率较高,对其他抗菌药物的耐药率较低。全基因组测序分析能够100%预测美罗培南、氟苯尼考、阿奇霉素和阿莫西林/克拉维酸的耐药性,而且对恩诺沙星、四环素、复方新诺明、氨苄西林、头孢噻呋、磺胺异噁唑的预测符合率均超过95.0%。【结论】本研究结果表明,全基因组测序技术对沙门氏菌的血清分型和耐药性的预测具有较高的准确性和敏感性,是分析沙门氏菌血清型和耐药性的有效工具,具备良好的应用前景。

关键词：沙门氏菌全基因组测序血清型耐药表型耐药基因型

耐氟喹诺酮类药物空肠弯曲菌HRM快速检测方法的建立

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中国兽医科学 2015年第5期45卷 441-447页

作者：崔明全吴辰斌汪洋沈建忠吴聪明中国农业大学动物医学院北京100193 中国兽医药品监察所北京100081

针对空肠弯曲菌介导氟喹诺酮类耐药决定区gyrA基因C-257-T位点突变,探讨高分辨率熔解曲线技术对其检测的可行性。选择gyrA基因已经被测序的菌株NCTC11168和ZP11作为高分辨率熔解曲线法的标准阴性和阳性菌株,建立评价高分辨率熔解曲线方... 详细信息

针对空肠弯曲菌介导氟喹诺酮类耐药决定区gyrA基因C-257-T位点突变,探讨高分辨率熔解曲线技术对其检测的可行性。选择gyrA基因已经被测序的菌株NCTC11168和ZP11作为高分辨率熔解曲线法的标准阴性和阳性菌株,建立评价高分辨率熔解曲线方法的阴性和阳性标准。利用该技术对已知氟喹诺酮类耐药表型的55株菌株进行检测,结果45株与耐药表型鉴定结果一致,准确率达到81.81%。高分辨率熔解曲线技术检测耐氟喹诺酮类药物空肠弯曲菌gyrA基因C-257-T位点突变具有简单、快速、无污染等优点,有望成为临床检测筛选高耐氟喹诺酮类药物空肠弯曲菌的优选方法。

关键词：空肠弯曲菌氟喹诺酮类药物 gyrA突变点高分辨率熔解曲线

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我国动物源细菌耐药性控制策略研究

中国兽医杂志 2021年第11期57卷 113-116页

作者：赵琪张纯萍王鹤佳丁晓妍宋立崔明全李霆程敏徐士新中国兽医药品监察所北京海淀100081 中国农业大学动物医学院北京海淀100193

细菌耐药性被认为是对全球公共卫生和食粮安全的重大威胁。各个国家已经意识到细菌耐药性对人类产生的巨大危害,并积极建立细菌耐药性监测系统[1-8],这在很大程度上减缓了耐药性蔓延。世界卫生组织(WHO)、联合国粮农组织(FAO)以及世界... 详细信息

细菌耐药性被认为是对全球公共卫生和食粮安全的重大威胁。各个国家已经意识到细菌耐药性对人类产生的巨大危害,并积极建立细菌耐药性监测系统[1-8],这在很大程度上减缓了耐药性蔓延。世界卫生组织(WHO)、联合国粮农组织(FAO)以及世界动物卫生组织(OIE)秉承"同一世界,同一健康"理念,同心协力应对危害人类公共卫生安全、生态安全和食品安全的抗微生物药物耐药性问题[9-12]。

关键词：细菌耐药性监测全球公共卫生抗微生物药物公共卫生安全耐药性问题动物源细菌食品安全

牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子流行特征和耐药性研究进展

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畜牧与兽医 2021年第10期53卷 121-126页

作者：李泽坤徐士新王鹤佳宋立邹明崔明全中国兽医药品监察所北京100081 青岛农业大学动物医学院山东青岛266109

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是WHO公布的重要的人医临床病原菌,同时也是重要的人畜共患病原菌,对其感染的治疗是临床上难题之一。目前,世界范围内牛源MRSA呈现多重耐药现象,部分相同... 详细信息

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是WHO公布的重要的人医临床病原菌,同时也是重要的人畜共患病原菌,对其感染的治疗是临床上难题之一。目前,世界范围内牛源MRSA呈现多重耐药现象,部分相同分子分型的MRSA克隆株已在牛和猪等不同家畜中检出,提示存在通过携带者向社区人群和医院患者传播的风险。目前的报道显示我国牛源MRSA分离株已表现出多重耐药性和分子多样性,应引起我国公共卫生领域的重视。本文综述了欧美和亚洲国家牛源MRSA耐药性和分子流行特征相关的研究成果,以期为评估我国MRSA的流行传播风险提供参考依据。

关键词：牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性分子特征

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沙门菌快速血清分型策略的应用

中国兽医杂志 2023年第1期59卷 48-52页

作者：崔明全李霆张纯萍程敏赵琪王鹤佳中国兽医药品监察所北京海淀100081 农业农村部动物源细菌耐药性监测重点实验室北京海淀100081

为建立一种对临床沙门菌株进行快速血清分型的策略,本研究尝试将玻片凝集法和液相芯片法进行联合应用。首先利用玻片凝集法对467株动物源沙门菌进行鉴定,然后对不能直接利用玻片凝集法鉴定血清型的沙门菌采用液相芯片法进行补充鉴定。... 详细信息

为建立一种对临床沙门菌株进行快速血清分型的策略,本研究尝试将玻片凝集法和液相芯片法进行联合应用。首先利用玻片凝集法对467株动物源沙门菌进行鉴定,然后对不能直接利用玻片凝集法鉴定血清型的沙门菌采用液相芯片法进行补充鉴定。结果显示,利用玻片凝集法可以直接检测409株沙门菌的O抗原和H抗原,包含49种血清型;结合液相芯片法在1 d内完成了其余58株沙门菌的O抗原和H抗原单因子的鉴定,共涉及10种血清型。结果表明,玻片凝集法具有快速鉴定O抗原优势,液相芯片法具有快速鉴定H抗原优势,2种方法结合应用的策略可以快速、高效地实现沙门菌血清分型的目的,可作为沙门菌血清型快速鉴定方案并予以推广。

关键词：沙门菌血清分型玻片凝集法液相芯片法快速鉴定