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GGTA1基因缺失五指山小型猪的制备

GGTA1基因缺失五指山小型猪的制备

作者：岳成鹤四川农业大学

学位级别：硕士

异种移植是解决人的移植用器官组织来源短缺问题的潜在解决途径之一,而猪被认为是异种器官组织的理想供体动物。以猪做供体向灵长类进行异种移植时存在一系列排斥反应,其中超急性排斥反应(HAR)是异种移植早期发生的首要免疫障碍。HAR是... 详细信息

异种移植是解决人的移植用器官组织来源短缺问题的潜在解决途径之一,而猪被认为是异种器官组织的理想供体动物。以猪做供体向灵长类进行异种移植时存在一系列排斥反应,其中超急性排斥反应(HAR)是异种移植早期发生的首要免疫障碍。HAR是由灵长类体内预存的针对αGa1表位的天然抗体介导产生的排斥反应。GGTA;基因的失活能够减少多数αGa1表位的产生,从而基本阻断HAR。本研究在已成功制备的GGTA1+/-五指山小型猪基础上,通过优化筛选方法获得了GGTA1基因缺失细胞,并通过体细胞核移植技术成功生产了GGTA1基因缺失五指山小型猪,结果如下：研究一：以GGTA1+/-胎儿成纤维细胞为材料,采用同源重组、抗性筛选标记为puro的第二轮基因打靶与嘌呤霉素进行细胞筛选,共获得了36个抗性细胞克隆,经PCR鉴定无GGTA1-/-细胞,表明该方法效率太低,不适于作为常规制备GGTA1-/-细胞的方法;研究二：以源于GGTA1+/-五指山小型猪再克隆胎儿的成纤维细胞系为材料,采用特异结合αGa1的药物GSI-B4和艰难梭菌毒素A(TcdA),结合免疫磁珠(MACS)和流式细胞术(FACS)筛选αGal表位缺失的细胞。通过GSI-B4联合免疫磁珠获得了11个单细胞克隆,其中2个是GGTA1-/-细胞克隆;联合MACS与FACS获得了3个细胞集落,经PCR鉴定不是预期的GGTA1-/-细胞克隆;TcdA联合FACS获得了4个细胞集落,经PCR鉴定,均为GGTA1-/-细胞克隆。实验共获得18个单细胞克隆／细胞集落,经PCR鉴定有6个是GGTA1-/-细胞克隆,效率为33.3%。研究三：以GGTA1-/-细胞为核供体,去核的体外成熟猪卵母细胞为胞质供体,通过体细胞核移植构建重构胚胎,将一定数量的重构胚移入受体母猪;总共向12.5头受体母猪移植重构胚3122枚,其中4头受体母猪怀孕至妊娠期满,出生存活五指山小型猪仔猪12头,经PCR、Southern blotting进行GGTA1基因型检测,鉴定出GGTA1-/-猪11头;采集克隆仔猪耳组织建立成纤维细胞系,经流式细胞术对细胞表面抗原αGa1的检测表明,GGTA1-/-猪的成纤维细胞表面几乎不表达αGa1,证实该11头五指山小型猪缺失GGTA1基因。上述结果表明,用特异性药物TcdA毒素、MACS和FACS可以将-Ga1表位缺失GGTA1基因缺失细胞筛选出来,而上述方法的适当联合可以获得较高的富集效率。单独采用基于同源重组的第二次基因打靶筛选GGTA1基因缺失细胞的效率太低,难以敲除突变型GGTA1基因的等位基因。本研究还首次证明了由流式细胞分选术制备的GGTA1-/-五指山小型猪胎儿成纤维细胞可以用于GGTA1基因缺失-五指山小型的制备。总之,本研究在国内首次成功制备GGTA1基因缺失五指山小型猪,为制备进一步消除HAR的异种移植研究用猪奠定了坚实的基础。

关键词：异种移植 GGTA1基因基因缺失五指山小型猪体细胞核移植

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电容层析成像测量甲醇制烯烃催化剂床层温度

洁净煤技术 2024年第5期30卷 136-143页

作者：陈锡岳孟霜鹤张涛叶茂中国科学院大连化学物理研究所辽宁大连116023 中国科学院大学北京100049

甲醇制烯烃作为煤制烯烃的关键一环,对实现煤炭的综合利用有重要意义。这一过程是典型的放热反应,为提高甲醇转化率与产物选择性,需对床层温度进行在线监测。基于高温电容层析成像,提出一种在线测量催化剂床层温度(DMTO工业催化剂,ZSM-... 详细信息

甲醇制烯烃作为煤制烯烃的关键一环,对实现煤炭的综合利用有重要意义。这一过程是典型的放热反应,为提高甲醇转化率与产物选择性,需对床层温度进行在线监测。基于高温电容层析成像,提出一种在线测量催化剂床层温度(DMTO工业催化剂,ZSM-5分子筛)的方法。通过与介电常数变化极小的石英砂、氧化铝等床层材料的测量结果对比,发现不同催化剂的介电常数随温度变化规律不同,催化剂床层的测量电容值随温度变化敏感且重复性较好。因此可通过高温电容层析成像装置测量温度分布均匀的床层归一化电容平均值实现对床层温度的测量。通过采用薄壁石英管的固定反应器,对甲醇制烯烃催化剂、ZSM-5分子床层进行在线测温验证了该方法的有效性,发现通过线性反投影算法重构的ECTt图像,可获得床层温度分布。由此,可以通过高温电容层析成像装置实现对固定床床层床层测温。

关键词：甲醇制烯烃分子筛催化剂在线测量电容层析成像温度

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应用半乳糖表型差异高效筛选α-1,3半乳糖苷转移酶基因缺失的猪成纤维细胞

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2014年第1期42卷 1-7页

作者：岳成鹤曹随忠李西睿冯冲龙川余树民储明星潘登科四川农业大学动物医学院四川雅安625014 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

【目的】筛选α-1,3半乳糖苷转移酶(α1,3galactosyl transferase,GGTA1)基因缺失的猪成纤维细胞。【方法】用同源重组载体pBS-GGTA1-SKO和pBS-GGTA1-DKO电转染GGTA1单等位基因敲除(GGTA1+/-)的五指山小型猪胎儿成纤维细胞,利用磁激活... 详细信息

【目的】筛选α-1,3半乳糖苷转移酶(α1,3galactosyl transferase,GGTA1)基因缺失的猪成纤维细胞。【方法】用同源重组载体pBS-GGTA1-SKO和pBS-GGTA1-DKO电转染GGTA1单等位基因敲除(GGTA1+/-)的五指山小型猪胎儿成纤维细胞,利用磁激活细胞分选(MACS)、MACS联合流式细胞术(FACS)、TcdA联合FACS等3种方法进行细胞筛选;对MACS筛选获得的单细胞克隆进行PCR和FACS鉴定,对MACS联合FACS、TcdA联合FACS获得的细胞集落进行PCR鉴定。【结果】经MACS筛选获得了11个细胞克隆,经鉴定2个是GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为18.2%;MACS联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定无GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为0;TcdA联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定均为GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为100%。【结论】MACS法筛选和TcdA联合FACS法筛选这2种方法均可以高效筛选出GGTA1双等位基因缺失的猪成纤维细胞,可用于进一步制备供异种器官移植的基因修饰小型猪。

关键词：五指山小型猪基因缺失 GGTA1基因成纤维细胞

基于CST的三维机翼气动结构解析参数化建模与优化方法

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航空动力学报 2024年第4期39卷 65-74页

作者：杨予成粟华龚春林谷良贤丁轩鹤王子一西北工业大学航天学院陕西省空天飞行器设计重点实验室西安710072

针对概念设计阶段机翼设计需要大范围探索设计空间并进行气动结构一体化设计的需求,提出一种基于类别/形状变换函数(class-shape function transformation,CST)的三维机翼气动结构解析参数化建模与优化方法。在二维CST基础上,推导三维CS... 详细信息

针对概念设计阶段机翼设计需要大范围探索设计空间并进行气动结构一体化设计的需求,提出一种基于类别/形状变换函数(class-shape function transformation,CST)的三维机翼气动结构解析参数化建模与优化方法。在二维CST基础上,推导三维CST参数化几何模型的解析函数形式,通过网格自适应离散与结构特征提取技术建立了三维机翼的气动和结构解析参数化模型,能够同时支持包括机翼几何构型、结构布局、结构尺寸、材料属性等参数的气动结构一体化快速建模与优化求解,具备几何模型大范围参数化以及气动、结构模型的建模过程自动化能力。采用该方法对某大展弦比机翼开展气动结构一体化优化设计,对比固定结构布局优化方案,优化结果梁由2个减至1个,翼肋由20个减至15个,质量相比减少26.1%。

关键词：几何建模解析参数化建模类别/形状变换函数机翼设计气动弹性优化

锌指核酸酶技术制备肌肉生长抑制素基因敲除的五指山小型猪成纤维细胞

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遗传 2013年第6期35卷 778-785页

作者：曹随忠岳成鹤李西睿冯冲龙川潘登科四川农业大学动物医学院雅安625014 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

敲除猪肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因可能提高猪瘦肉率,MSTN基因敲除猪也可作为相关疾病的动物模型。文章利用锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)技术敲除五指山小型猪胎儿成纤维细胞MSTN基因,为制备MSTN基因敲除猪奠定基础... 详细信息

敲除猪肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因可能提高猪瘦肉率,MSTN基因敲除猪也可作为相关疾病的动物模型。文章利用锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)技术敲除五指山小型猪胎儿成纤维细胞MSTN基因,为制备MSTN基因敲除猪奠定基础。ZFNs质粒或编码ZFNs的mRNA均能高效敲除MSTN基因,使用ZFNs mRNA能直接得到MSTN+/-和MSTN-/-两种基因型的细胞克隆。DNA序列测定与分析发现,细胞克隆的突变类型多为ZFNs作用靶位点处不大于10 bp的碱基插入或缺失(92.18%);氨基酸预测发现,突变型MSTN基因的终止密码子常常提前出现。将MSTN基因敲除的细胞进行体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)发现,胚胎体外早期发育潜力与野生型无显著差异,表明这些细胞可用于后续MSTN基因敲除猪的制备。

关键词：肌肉生长抑制素基因敲除五指山小型猪锌指核酸酶 MSTN- -成纤维细胞

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浅埋暗挖交叉相贯隧道施工力学行为试验研究

建筑科学与工程学报 2024年第2期41卷 115-123页

作者：崔凌岳王福文孙铁成中铁十八局集团第一工程有限公司河北涿州072750 北京城建设计发展集团股份有限公司北京100037 石家庄铁道大学省部共建交通工程结构力学行为与系统安全国家重点实验室河北石家庄050043 石家庄铁道大学道路与铁道工程安全保障省部共建教育部重点实验室河北石家庄050043

为完善浅埋暗挖交叉相贯隧道在施工过程中的受力形式及变形特征,依托青岛某地铁工程,根据所选地铁车站的地质条件及衬砌结构特点浇筑衬砌模型并配制围岩相似材料,利用模型试验对采用全断面法在Ⅴ级围岩环境下进行的风道和车站主体开挖... 详细信息

为完善浅埋暗挖交叉相贯隧道在施工过程中的受力形式及变形特征,依托青岛某地铁工程,根据所选地铁车站的地质条件及衬砌结构特点浇筑衬砌模型并配制围岩相似材料,利用模型试验对采用全断面法在Ⅴ级围岩环境下进行的风道和车站主体开挖过程的力学行为展开研究,并从隧道衬砌结构变形及地层内部位移变化规律两方面分析了浅埋暗挖交叉相贯隧道全断面开挖施工的力学行为。结果表明:对于交叉相贯位置处的隧道结构,已有隧道结构将改变后续施工隧道衬砌结构应变最大值及其出现位置;位于交叉相贯隧道结构附近不同象限内的围岩分别处于水平变形累加区和往复区;地表竖向变形最大点位于后续施工的车站上方且与交叉相贯位置存在一定距离,而在交叉相贯位置处的地表竖向变形值稍小;模型试验明确了交叉相贯隧道在施工过程中围岩及衬砌结构的变形特征,给出了隧道结构地表最大变形与施工步序间的时空关系;研究结果可为相关交叉相贯隧道结构的施工及设计提供依据。

关键词：地下结构交叉相贯隧道模型试验浅埋暗挖地表沉降

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数字孪生机翼损伤模式快速识别与监测方法

航空动力学报 2024年第6期39卷 107-115页

作者：王子一粟华龚春林蔡艳芳丁轩鹤杨予成西北工业大学航天学院西安710072 西北工业大学空天飞行技术研究所西安710072 西安现代控制研究所西安710065

针对飞行器结构健康监测过程中存在的识别流程复杂、实时性较差问题,提出一种基于数字孪生技术的飞行器机翼损伤模式识别与监测方法。采用模块化技术构建飞行器机翼的数字孪生结构模型,基于概率神经网络建立了传感器数据在结构数字孪生... 详细信息

针对飞行器结构健康监测过程中存在的识别流程复杂、实时性较差问题,提出一种基于数字孪生技术的飞行器机翼损伤模式识别与监测方法。采用模块化技术构建飞行器机翼的数字孪生结构模型,基于概率神经网络建立了传感器数据在结构数字孪生模型中的映射方法,形成了通用的数字孪生飞行器结构损伤模式快速识别流程。以某无人机为例,基于此流程方法建立了其机翼的损伤模式快速识别模型并开展了对损伤的识别。结果表明:构建的飞行器结构数字孪生识别模型对损伤模式的识别准确率达到了96%以上,能够实现动态航迹规划任务。

关键词：结构健康监测数字孪生损伤模式模式识别概率神经网络

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基于数字孪生的航空发动机配合界面装配分析

航空学报 2024年

作者：李瑾岳张鹏飞郭跃成徐茂程赵罡北京航空航天大学航空发动机研究院中国航发湖南动力机械研究所北京航空航天大学机械工程及自动化学院

随着航空发动机零部件加工精度和质量稳定性的提升，装配精度逐渐成为影响产品精度的关键因素。目前已有基于数学模型的装配误差分析方法，能够实现配合界面形位偏差对产品最终装配偏差影响的预测。然而，这些方法受到建模方法的限制，... 详细信息

随着航空发动机零部件加工精度和质量稳定性的提升，装配精度逐渐成为影响产品精度的关键因素。目前已有基于数学模型的装配误差分析方法，能够实现配合界面形位偏差对产品最终装配偏差影响的预测。然而，这些方法受到建模方法的限制，对配合界面的几何物理信息进行了简化拟合。虽然能够增加计算分析的便捷性，但是也导致其无法足够准确地表征表面形貌偏差特征，进而导致无法准确分析其对装配的影响。特别是面向航空发动机等精密机械产品，装配配合界面形貌的微小几何偏差会在大载荷条件下对产品质量和稳定性产生重要影响。因此，提出一种基于数字孪生的装配偏差分析方法。以数字孪生技术为框架，使用肤面模型作为特征表面的建模方法，结合实测数据驱动的多因素仿真模型，实现装配界面变动对装配精度影响的综合分析。开发了发动机装配界面试验件，并通过对比试验和模拟结果，验证了所提出数字孪生方法的有效性。

关键词：航空发动机配合界面数字孪生装配分析形貌测量数字化仿真

利用体细胞LOH突变制备α1,3-半乳糖基转移酶基因(GGTA1)缺失的五指山小型猪

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畜牧兽医学报 2013年第4期44卷 522-527页

作者：王飞冯冲龙川岳成鹤王宁李西睿曹随忠李明洲储明星潘登科帅素容四川农业大学动物遗传育种研究所雅安625014 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室北京100193

制备α1,3-半乳糖基转移酶(αl,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因缺失的五指山小型猪,为我国异种器官移植研究奠定基础。在已经获得的GGTA1单等位基因敲除(GGTA+/-)五指山小型猪基础上,建立GGTA1+/-猪耳成纤维细胞系。利用特异性结合... 详细信息

制备α1,3-半乳糖基转移酶(αl,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因缺失的五指山小型猪,为我国异种器官移植研究奠定基础。在已经获得的GGTA1单等位基因敲除(GGTA+/-)五指山小型猪基础上,建立GGTA1+/-猪耳成纤维细胞系。利用特异性结合α1,3Gal的药物GSI-B4联合免疫磁珠筛选,成功分离出自发杂合性缺失(Loss of heterozygosity,LOH)的双等位基因敲除(GGTA1-/-)耳成纤维细胞。单细胞克隆培养与PCR鉴定后,以GGTA1-/-细胞为核供体,体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎并移植。先后将3 122枚重构胚移植到13头受体母猪,其中4头怀孕,产仔12头。采用PCR和Southern blotting进行GGTA1基因型检测,11头为GGTA1-/-猪;流式细胞术分析表明,GGTA1-/-仔猪耳成纤维细胞不表达α1,3Gal。获得能克服异种器官超急性排斥反应(HAR)的GGTA1-/-猪,不仅为异种器官供体的进一步基因修饰提供了平台,也为异种移植临床前研究提供了宝贵资源。

关键词： α1,3-半乳糖基转移酶自发杂合性缺失异种器官移植体细胞核移植五指山小型猪