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基于3D肝细胞球模型评价何首乌醇提物毒性研究

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中国临床药理学杂志 2024年第9期40卷 1272-1276页

作者：苏华龙姚香草陈佳敏岑柏宏王萍陈宗正许重远南方医科大学南方医院临床药学中心广东广州510515 南方医科大学药学院国家药品监督管理局药物代谢研究与评价重点实验室&广东省新药筛选重点实验室广东广州510515 深圳大学第一附属医院广东深圳518035

目的探究何首乌醇提物对3D肝细胞球的毒性。方法设置不同的条件以及细胞比例,测量细胞球直径、致密度、圆度,探索最佳培养条件。3D肝细胞球分为对照组和低、中、高剂量实验组,低、中、高剂量实验组给予0.25、1.00和2.50 mg·mL^(-1)何... 详细信息

目的探究何首乌醇提物对3D肝细胞球的毒性。方法设置不同的条件以及细胞比例,测量细胞球直径、致密度、圆度,探索最佳培养条件。3D肝细胞球分为对照组和低、中、高剂量实验组,低、中、高剂量实验组给予0.25、1.00和2.50 mg·mL^(-1)何首乌醇提物,对照组给予等量的培养基。用CellTiter-Glo试剂检测细胞球活性,用荧光定量聚合酶链反应(RT-qRCR)检测肝功能相关基因表达水平,用活死细胞双荧光染色试剂检测细胞球的毒性作用。结果细胞球理想接种条件为每微孔500个细胞,细胞比例为HepG2-Huvec-LX-2=8∶1∶1,圆度为0.91±0.07,坚实度为0.91±0.02,长径比为1.12±0.14,直径为(170.97±14.79)μm;第3、7、10和14天细胞球白蛋白(ALB)mRNA相对表达水平分别为1.00±0.02、0.96±0.02、0.54±0.07和0.52±0.07,细胞色素P4501A2(CYP1A2)mRNA相对表达水平分别为1.00±0.10、2.15±0.16、2.45±0.33和1.30±0.03。对照组和低、中、高剂量实验组多药耐药蛋白2(MRP2)mRNA相对表达水平分别为1.00±0.31、1.38±0.24、1.48±0.06和1.90±0.08,细胞球存活率分别为(98.19±0.49)%、(88.53±0.90)%、(71.60±2.91)%和(56.65±5.41)%。低、中、高剂量实验组上述指标与对照组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论建立的肝细胞球共培养模型中Ⅰ/Ⅱ相药物代谢酶、转运体、及肝细胞特异标志性分子白蛋白均有不同程度的表达,可用于中药何首乌的毒性评价,为何首乌的临床应用提供了参考。

关键词：何首乌肝毒性模型共培养 3D细胞球

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类器官技术在新药临床试验研究中的应用现状

中国临床药理学杂志 2023年第13期39卷 1967-1971页

作者：何嘉丽谢翠莹岑柏宏古安城姚香草车津晶许重远南方医科大学南方医院临床药学中心广东广州510515 南方医科大学国家药品监督管理局药物代谢研究与评价重点实验室及广东省新药筛选重点实验室广东广州510515 军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

类器官是一种在体外由干细胞或器官祖细胞诱导分化形成的三维结构的组织类似物,能够高度模拟体内器官的结构与功能,保留遗传和表观特征;其具良好的发展前景,有望推动疾病的临床研究,因而备受关注。近年来,类器官逐步被应用到临床试验中... 详细信息

类器官是一种在体外由干细胞或器官祖细胞诱导分化形成的三维结构的组织类似物,能够高度模拟体内器官的结构与功能,保留遗传和表观特征;其具良好的发展前景,有望推动疾病的临床研究,因而备受关注。近年来,类器官逐步被应用到临床试验中,助力新药研发。本文将介绍类器官的来源及其在新药临床试验中应用情况、相关法律法规的现况,总结类器官技术在新药临床试验研究应用的进展。

关键词：类器官新药研发临床试验

联合沉默转化生长因子受体Ⅰ及结缔组织生长因子基因对胶质母细胞瘤细胞血管拟态及其干细胞形成的影响

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中国临床药理学杂志 2023年第11期39卷 1572-1576页

作者：陈章浦岑柏宏陈佳扬杨伶黎权辉庞建新季爱民南方医科大学第七附属医院药学科广东佛山5282002 南方医科大学药学院广东广州510515 南方医科大学南方医院临床药学中心广东广州510515

目的研究siRNA单独或联合沉默胶质母细胞瘤细胞中的转化生长因子受体Ⅰ(TGFβR1)和结缔组织生长因子(CTGF)表达对其血管拟态生成和肿瘤干细胞成球生长的影响。方法以U87MG为模式细胞,空白组不给予转染,阴性对照组转染siNC,siTGFβR1组、... 详细信息

目的研究siRNA单独或联合沉默胶质母细胞瘤细胞中的转化生长因子受体Ⅰ(TGFβR1)和结缔组织生长因子(CTGF)表达对其血管拟态生成和肿瘤干细胞成球生长的影响。方法以U87MG为模式细胞,空白组不给予转染,阴性对照组转染siNC,siTGFβR1组、siCTGF组和双靶点组分别转染siTGFβR1、siCTGF、siTGFβR1联合siCTGF。以实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测siRNA的沉默效率,以血管拟态生成和肿瘤干细胞成球实验检测各组的抑制效果。结果siTGFβR1组和siCTGF组的mRNA沉默效率分别为(83.83±2.93)%和(84.42±5.68)%,蛋白沉默效率分别为(69.65±6.82)%和(64.41±3.88)%,与空白组及阴性对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。siTGFβR1组、siCTGF组和双靶点组的拟态血管分支点比值分别为(54.15±3.96)%、(62.87±4.91)%和(37.36±1.34)%,成球实验肿瘤球数量比值分别为(57.00±10.95)%、(68.50±14.32)%和(32.00±8.91)%;与空白组及阴性对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论单靶点siTGFβR1和siCTGF均可有效抑制U87MG的血管拟态生成和肿瘤干细胞形成,而同时沉默双靶点基因的表达其抑制功效更强。

关键词：胶质母细胞瘤血管拟态生成肿瘤干细胞小干扰RNA 转化生长因子受体Ⅰ 结缔组织组织生长因子

siRNAs对原代人脐静脉内皮细胞血管生成的影响

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中国临床药理学杂志 2022年第9期38卷 904-907页

作者：陈佳扬黎权辉岑柏宏陈章浦杨伶庞建新付卫明季爱民南方医科大学药学院广东510515 南方医科大学第七附属医院药学科广东佛山528200 广州医科大学附属肿瘤医院放疗科广东广州510095

目的研究siRNA单独或多重沉默原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中血管内皮细胞生长因子A(VEGFA)及血管内皮细胞生长因子受体1/2/3(VEGFR1/2/3)表达对其血管生成的影响。方法 HUVECs分为空白对照组,阴性对照组与实验组。空白对照组不给予转... 详细信息

目的研究siRNA单独或多重沉默原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中血管内皮细胞生长因子A(VEGFA)及血管内皮细胞生长因子受体1/2/3(VEGFR1/2/3)表达对其血管生成的影响。方法 HUVECs分为空白对照组,阴性对照组与实验组。空白对照组不给予转染,阴性对照组转染100 nmol·L^(-1)siNC,实验组分为4组并分别转染100 nmol·L^(-1)siVEGFA及siVEGFR1/2/3。以反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测siRNAs的沉默效率。HUVECs分为空白对照组,阴性对照组,沉默单靶点组和多靶点组,空白对照组不给予转染,阴性对照组转染100 nmol·L^(-1)siNC,沉默单靶点组分为4组并分别转染100 nmol·L^(-1)siVEGFA及siVEGFR1/2/3,沉默多靶点组分为4组并分别转染100 nmol·L^(-1)siVEGFA+siVEGFR1、siVEGFA+siVEGFR2、siVEGFA+siVEGFR3及siVEGFR1+siVEGFR2+siVEGFR3,以小管形成实验检测各组HUVECs小管形成情况。结果 siVEGFA组、siVEGFR1组、siVEGFR2组与siVEGFR3组沉默效率分别为(85.67±10.50)%,(71.67±7.02)%,(89.00±11.36)%与(90.00±3.60)%,与空白及阴性对照组相比,差异均有统计学意义(均P<0.01)。siVEGFA组血管总长度、分支管长度和血管交叉点分别为(32.67±3.79)%,(22.67±2.08)%及(25.33±6.43)%,在沉默单靶点组中抑制血管生成能力最强(均P<0.05);siVEGFA+siVEGFR3组血管总长度、分支管长度和血管交叉点分别为(28.33±5.51)%,(10.00±2.65)%,(8.33±2.31)%,siVEGFR1+siVEGFR2+siVEGFR3组分别为(27.00±4.00)%,(9.33±2.89)%,(10.00±3.60)%,在沉默多靶点组中抑制血管生成能力最强(均P<0.05)。结论 siRNAs沉默VEGF通路中单靶点的表达,可有效抑制HUVECs诱导的血管生成;同时沉默多靶点的表达,其抑制血管生成的功效更强。

关键词：原代人脐静脉内皮细胞血管内皮细胞生长因子A 血管内皮细胞生长因子受体小干扰RNA 血管生成

靶向卵巢癌细胞的miR-16/多肽纳米递释系统的制备及其功能验证

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南方医科大学学报 2021年第5期41卷 736-746页

作者：黎权辉岑柏宏黄文陈佳扬陈章浦庞建新付卫明贺帅季爱民南方医科大学药学院广东广州510515 广州医科大学附属肿瘤医院放疗科广东广州510095 南方医科大学附属南海医院药剂科广东佛山528200 南方医科大学珠江医院药学部广东广州510282

目的研制增强顺铂敏感性的miR-16/多肽纳米递释系统,实现miRNA的卵巢癌靶向给药并验证其功能。方法合成R9-SS-R9及cRGD-R9-SS-R9多肽,并与miR-16 mimic分子自组装形成纳米递释系统。利用琼脂糖凝胶电泳技术、粒径电位仪及透射电镜,测定... 详细信息

目的研制增强顺铂敏感性的miR-16/多肽纳米递释系统,实现miRNA的卵巢癌靶向给药并验证其功能。方法合成R9-SS-R9及cRGD-R9-SS-R9多肽,并与miR-16 mimic分子自组装形成纳米递释系统。利用琼脂糖凝胶电泳技术、粒径电位仪及透射电镜,测定纳米粒的稳定性、粒径、电位及形态等表征结果。利用CCK-8检测多肽对细胞的毒性。利用茎环qRT-PCR技术、活细胞成像技术验证纳米粒的摄取效率及细胞内分布。利用流式细胞术及Westernblot技术,验证纳米粒增强卵巢癌细胞顺铂敏感性的作用及其机制。结果成功制备R9-SS-R9/miR-16、cRGD-R9-SS-R9/miR-16纳米粒,以5∶1的多肽/miRNA重量配比制得的纳米粒粒径在150 nm以下,分散指数小于0.1,电位约为40 mV,血清稳定性良好。多肽材料无明显的细胞毒性。miR-16/多肽纳米粒可被人卵巢癌细胞充分摄取并分布在细胞质中,且显著提高细胞内miR-16分子的表达水平(P<0.001),降低细胞中Bcl-2、Chk-1蛋白表达,实现miR-16的促细胞凋亡以及增强细胞对顺铂敏感性的作用。结论成功制备了miR-16/多肽纳米递释系统,且该系统具有增强卵巢癌顺铂敏感性的功能。

关键词： miRNA 纳米递释系统卵巢癌

血清饥饿对原代人脐静脉内皮细胞周期同步化的影响

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南方医科大学学报 2016年第8期36卷 1140-1143页

作者：覃乙芯吴卓敏徐茜廖文婕贺帅岑柏宏廖路敏王震季爱民南方医科大学珠江医院药剂科广东广州510282

目的探讨人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的最佳饥饿条件,以建立高效稳定的HUVECs体外分离提取方法,并为HUVECs相关实验提供研究基础。方法用0.1%Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉腔消化15 min,收集细胞并用内皮... 详细信息

目的探讨人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的最佳饥饿条件,以建立高效稳定的HUVECs体外分离提取方法,并为HUVECs相关实验提供研究基础。方法用0.1%Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉腔消化15 min,收集细胞并用内皮细胞专用培养基(含5%内皮细胞基础培养基、1%内皮细胞生长因子、1%青链霉素),置37℃,5%CO2培养箱培养。在倒置显微镜下观察细胞形态特点,并用细胞免疫荧光方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术检测所得HUVECs的纯度,并检测0%、0.1%、0.5%、1%血清浓度的培养基饥饿处理0、6、12、18、24 h对细胞周期的影响。结果 0.1%Ⅱ型胶原酶消化可以得到HUVECs,细胞培养呈典型的铺卵石状排列,细胞较密处呈涡旋状排列。免疫荧光检测细胞VIII因子相关抗原表达呈阳性。流式检测细胞纯度高达99.67%。不同血清浓度培养基培养6 h可获得70%左右的G0/G1期细胞;培养12 h可获得80%~90%的G0/G1期细胞;培养18、24 h可获得95%左右的G0/G1期细胞。结论 0.1%Ⅱ型胶原酶充盈静脉管腔可以获得高纯度的原代HUVECs。完全无血清培养基培养12 h即可获得纯度超过80%的G0/G1期HUVECs。

关键词：人脐静脉内皮细胞细胞原代培养血清饥饿细胞周期

不同基因型胶质母细胞瘤细胞系辐射抵抗性差异研究

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实用医学杂志 2021年第12期37卷 1520-1528页

作者：简海锋梁惠平岑柏宏袁亚维广州医科大学附属肿瘤医院放疗科广州510095

目的探讨不同基因型胶质母细胞瘤细胞系辐射抵抗性的差异及其原因。方法选取三种不同基因型GBM细胞系(U87MG、U251MG、U118MG),利用外显子测序技术检测P53、PTEN基因突变情况,蛋白免疫印迹检测MGMT表达情况。不同剂量(2、5、10 Gy)辐射... 详细信息

目的探讨不同基因型胶质母细胞瘤细胞系辐射抵抗性的差异及其原因。方法选取三种不同基因型GBM细胞系(U87MG、U251MG、U118MG),利用外显子测序技术检测P53、PTEN基因突变情况,蛋白免疫印迹检测MGMT表达情况。不同剂量(2、5、10 Gy)辐射后,采用流式细胞术检测细胞凋亡水平、平板克隆形成检测细胞增殖能力,分析其辐射抵抗性。利用蛋白免疫印迹检测DNA损伤标记蛋白(γH2AX)、NF⁃κB效应分子(RELA/p65)及EGFR在辐射后48 h内激活情况,分析DNA损伤与NF⁃κB及EGFR信号通路激活的相关性。结果U87MG、U251MG、U118MG均存在P53与PTEN的突变位点,其中U87MG、U251MG低表达MGMT,U118MG高表达MGMT。经过2、5、10 Gy辐射后48 h,各剂量均存在凋亡率变化值:U87MG>U118MG>U251MG,存活分数:U251MG>U118MG>U87MG。三种细胞系经辐射后γH2AX、RELA/p65、EGFR的激活均存在时间与剂量差异性。结论辐射抵抗性:U251MG>U118MG>U87MG,提示GBM细胞系辐射抵抗性与其基因型有关。三种细胞系辐射后NF⁃κB通路与EGFR通路的激活存在差异,最终导致其辐射抵抗性差异。

关键词：胶质母细胞瘤电离辐射辐射抵抗性

乌榄叶水提取物对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用

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实用医学杂志 2017年第6期33卷 885-889页

作者：郑凌云岑柏宏梁燕玲吕竹芬董艳芬广东药科大学基础学院生理教研室广州市510260 广东药科大学药物制剂专业广州市510260 广东药科大学药物研究所广州市510260

目的:明确乌榄叶水提取物对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法:采用Langendorff离体心脏灌流术,结扎冠脉左前降支35 min,分别复灌10 min和50 min制备不同程度缺血再灌注损伤模型。用乌榄叶水提物制备灌流液对离体心脏进行灌... 详细信息

目的:明确乌榄叶水提取物对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法:采用Langendorff离体心脏灌流术,结扎冠脉左前降支35 min,分别复灌10 min和50 min制备不同程度缺血再灌注损伤模型。用乌榄叶水提物制备灌流液对离体心脏进行灌注并观察:(1)乌榄叶水提物预处理对正常离体心脏功能的影响;(2)乌榄叶水提物预处理10 min后制备缺血再灌注模型,观察:(1)左心室功能及冠脉流量;(2)室颤或室速发生率;(3)冠脉流出液中肌酸激酶及乳酸脱氢酶活性;(4)缺血再灌注损伤的病理变化。结果:乌榄叶水提取物可有效提高正常左心室功能,且可有效降低不同程度再灌注损伤引起的左室LVEDP及+dp/dtmax的变化,提高心脏顺应性,降低室颤或室速的发生率,并抑制冠脉流出液中肌酸激酶及乳酸脱氢酶活性以及缺血再灌注引起的心肌病变。结论:乌榄叶水提取物对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤具有保护作用。

关键词：心肌缺血再灌注损伤乌榄叶乳酸脱氢酶肌酸激酶

siRNA介导的PD-L1沉默可增强人CD8~＋T淋巴细胞的体外杀伤作用

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南方医科大学学报 2018年第7期38卷 800-806页

作者：王震黄文岑柏宏魏媛怡廖路敏黎国仙季爱民南方医科大学珠江医院药剂科广东广州510282 南京制药厂有限公司新药研发中心江苏南京210007 邵阳市中心医院药剂科湖南邵阳422000 广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤放射中心广东广州510095

目的设计并筛选多条可高效特异性降低肿瘤细胞表面沉默程序性死亡受体-配体1(PD-L1)表达的小干扰RNA(siRNA)序列,并研究其增强人CD8^+T淋巴细胞对人胶质瘤细胞(U87 MG)免疫杀伤作用。方法根据siRNA设计法则,并通过siDirect软件在线设计... 详细信息

目的设计并筛选多条可高效特异性降低肿瘤细胞表面沉默程序性死亡受体-配体1(PD-L1)表达的小干扰RNA(siRNA)序列,并研究其增强人CD8^+T淋巴细胞对人胶质瘤细胞(U87 MG)免疫杀伤作用。方法根据siRNA设计法则,并通过siDirect软件在线设计针对PD-L1基因的几种不同的siRNA序列,并运用BLAST进行同源性分析,最终确定候选序列;通过RT-qPCR、Western blot及流式细胞术实验,选出高效抑制PD-L1 mRNA及蛋白表达的siRNA序列;通过流式细胞术及CCK8检测PD-L1siRNA沉默U87 MG细胞的PD-L1后,人CD8^+T细胞对U87 MG的细胞凋亡及增殖的影响。结果设计了10条针对人PD-L1基因具有不同核苷酸序列的siRNA。采用RT-qPCR、Western blot及流式细胞术在mRNA及蛋白水平上检测siRNA的沉默效率,与对照组相比,siPD-L1-1、siPD-L1-2、siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8均显著降低U87 MG中PD-L1基因的表达(P<0.05),其中siPD-L1-3的沉默效率最高。与对照组相比,流式细胞术及CCK8结果显示,siPD-L1-3及siPD-L1-8均可显著增强人CD8^+T细胞对U87 MG细胞的杀伤作用,且该杀伤作用可显著抑制U87 MG细胞增殖(P<0.05)。结论本文设计并筛选了能有效沉默PD-L1基因表达的siPD-L1-1、siPD-L1-2、siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8的6条序列,其中siPD-L1-3和siPD-L1-8可高效增强T淋巴细胞对U87 MG细胞免疫杀伤作用,且siPD-L1-3的作用最为显著。本文设计的PD-L1siRNA分子可以用于设计和制备预防、治疗多种癌症的核酸药物。

关键词：程序性死亡受体-配体1 小干扰RNA 神经胶质瘤细胞 CD8+T细胞核酸药物