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2019—2022年广西鸭圆环病毒分子流行病学研究

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中国畜牧兽医 2024年第1期51卷 373-381页

作者：熊陈勇曾素先刘惠心赵康施开创施喻文谢守玉韦显凯龙凤冯淑萍屈素洁王露霞林昌华尹彦文广西大学动物科学技术学院南宁530005 南宁市江南区沙井街道办事处水产畜牧兽医站南宁530031 广西农垦永新畜牧集团西江有限公司贵港537104 广西动物疫病预防控制中心南宁530001 百色市动物疫病预防控制中心百色533000

【目的】了解广西鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)的遗传进化特征。【方法】试验于2019—2022年从广西地区采集761份病死鸭临床样本,利用实时荧光定量PCR检测DuCV感染情况。通过PCR扩增DuCV全基因组序列,利用DNAStar分析其与参考毒株... 详细信息

【目的】了解广西鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)的遗传进化特征。【方法】试验于2019—2022年从广西地区采集761份病死鸭临床样本,利用实时荧光定量PCR检测DuCV感染情况。通过PCR扩增DuCV全基因组序列,利用DNAStar分析其与参考毒株核苷酸和氨基酸序列相似性,使用RDP4和SimPlot 3.5.1软件分析DuCV重组事件,采用Mega 7.0软件构建遗传进化树,应用BioEdit软件分析DuCV Cap蛋白氨基酸变异位点。【结果】DuCV阳性率为22.5%,基因组大小为1988~1996 bp。广西DuCV毒株全基因组、Rep和Cap基因与参考毒株核苷酸序列相似性分别为71.9%~99.6%、83.1%~99.9%和52.8%~99.9%。基因重组分析显示,DuCV-GX13-2019和DuCV-GX14-2020存在重组事件。Cap蛋白共有78个氨基酸位点发生突变,与DuCV-1相比,DuCV-2在第3、12、15、23、31、42、56和64位氨基酸处完全变异。广西毒株为DuCV-1和DuCV-2基因型,DuCV-1为主要优势毒株,且DuCV-1b亚型流行最为广泛。【结论】广西地区DuCV发病较严重,部分毒株存在重组事件,Cap蛋白突变率高,DuCV多种亚型均有流行。研究结果为广西地区DuCV流行病学调查提供基本数据。

关键词：鸭圆环病毒(DuCV) 遗传进化相似性流行病学

猪圆环病毒2型LC株ORF2基因片段的原核表达及间接ELISA诊断方法的初步建立

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猪圆环病毒2型LC株ORF2基因片段的原核表达及间接ELISA诊断方法的...

作者：屈素洁广西大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)等相关疾病的主要病原。给世界养猪业造成巨大的经济损失。了解PCV2的流行情况，可以给PCV2的预防... 详细信息

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)等相关疾病的主要病原。给世界养猪业造成巨大的经济损失。了解PCV2的流行情况，可以给PCV2的预防和控制提供指导。猪圆环病毒ORF2基因编码病毒的主要结构蛋白Cap蛋白，该蛋白具有良好免疫原性。PCV1和PCV2 ORF2基因序列的核苷酸同源性仅为67％，两种血清型的Cap蛋白虽存在共同的抗原决定簇，但两者没有抗原交叉性，因而是区分PCV1和PCV2的重要蛋白。根据猪圆环病毒2型(PCV2)LC株序列，设计合成5对引物，采用PCR方法从全序列重组质粒PCV2-LC中扩增出了ORF2基因和4个不同长短ORF2基因片段，分别将其克隆到原核表达载体PET-32a上，经酶切、序列测序正确后，再分别将各个重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，用终浓度1mmol／L IPTG诱导，表达产物以包涵体的形式存在。经Western-Blot检测表明，表达的重组蛋白ORF2b、ORF2c、ORF2d能够被PCV2阳性血清所识别，具有良好的抗原性。用含有2mol／L、4 mol／L和8 mol／L尿素的包涵体洗涤液多次洗涤溶解包涵体后，用Ni亲和层析柱对重组蛋白进行纯化，获得了理想的纯化效果。利用表达的重组融合蛋白ORF2c作为抗原，建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法，并对ELISA的反应条件进行了摸索，确定了最适工作条件。结果表明，重组蛋白抗原的最适包被浓度为0.24μg／ml，最适包被条件为4℃过夜加37℃2h，待检血清的稀释度为1：40，HRP-兔抗猪IgG的工作浓度为1：4000，待检血清和酶标二抗的反应条件和反应时间均为37℃30min，底物室温显色15min，阴阳性临界值为0.39。用建立的间接ELISA方法检测了160份临床血清样品，并与市售的ELISA诊断试剂盒的检测结果相比较，敏感性和特异性分别为90.4％和97.2％，总符合率达95％。两种检测方法的结果之间差异不显著(P＞0.05)。试验表明，建立的间接ELISA检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点，可用于PCV2血清抗体的检测。

关键词： PCV2 ORF2片段原核表达间接ELISA检测

猪圆环病毒三重PCR检测方法的建立及其广西地区流行病学调查

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中国兽医学报 2022年第3期42卷 413-420页

作者：赵晶施开创刘惠心尹彦文龙凤陆文俊屈素洁司红彬广西大学动物科学技术学院广西南宁530005 广西动物疫病预防控制中心广西南宁530001

针对当前我国流行的猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)1型(PCV1)、2型(PCV2)和3型(PCV3),设计3对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度和循环次数的优化,建立了鉴别检测PCV1、PCV2和PCV3的三重PCR方法。结果显示,该方法具有良好的特... 详细信息

针对当前我国流行的猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)1型(PCV1)、2型(PCV2)和3型(PCV3),设计3对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度和循环次数的优化,建立了鉴别检测PCV1、PCV2和PCV3的三重PCR方法。结果显示,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,只能检出PCV1、PCV2和PCV3,其他猪病毒均未能扩出;对PCV1、PCV2和PCV3质粒标准品的检测下限分别为3.63×10^(3),3.63×10^(1),3.63×10^(2)拷贝/μL;相同条件下的扩增获得均匀一致的结果。利用所建立的三重PCR方法检测2018—2020年采自广西各地的1308份猪组织病料,结果显示,PCV1、PCV2和PCV3的阳性率分别为2.14%,56.65%,5.58%,并存在混合感染现象;PCV1、PCV2阳性率逐年下降,PCV3阳性率稳定控制,不同地市之间阳性率有所差异。结果表明,本研究成功建立了一种快速、特异、灵敏、经济的三重PCR方法,可用于PCV1、PCV2和PCV3的鉴别检测和流行病学调查;当前广西猪群普遍感染PCV1、PCV2和PCV3,应加强防控。

关键词：猪圆环病毒三重PCR 流行病学调查

猪源脑心肌炎病毒GXLC株全基因组序列测定与分析

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病毒学报 2010年第2期26卷 134-142页

作者：施开创屈素洁陈进喜许瑞胜郑敏刘棋陈汉忠李刚中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 广西动物疫病预防控制中心南宁530001 广西大学动物科学技术学院南宁530005

对猪源脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株进行全基因组克隆、测序和分析。采用RT-PCR技术分段扩增基因组可读框(ORF),应用3'-RACE和5'-RACE技术扩增3'-UTR和5'-UTR,分别对扩增片段进行克隆和测序,经拼接后获得GXLC株全基因组序列,共7725个核苷... 详细信息

对猪源脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株进行全基因组克隆、测序和分析。采用RT-PCR技术分段扩增基因组可读框(ORF),应用3'-RACE和5'-RACE技术扩增3'-UTR和5'-UTR,分别对扩增片段进行克隆和测序,经拼接后获得GXLC株全基因组序列,共7725个核苷酸。与NCBI GenBank登录的国内外参考毒株进行同源性比较及系统进化分析结果表明,GXLC株与GX0601、GX0602、BJC3、HB1等国内分离株以及CBNU、K3、K11、BEL-2887A、EMCV-R、PV21等国外分离株同源性达99%以上;基于全基因组、结构蛋白及非结构蛋白基因序列绘制的系统进化树拓扑结构图相近,所有EMCV分离株可分成两个群:I群和II群,I群可细分为Ia亚群和Ib亚群,其中猪源EMCV属于Ia或Ib亚群、鼠源EMCV属于Ia亚群、野猪源EMCV属于II群,GXLC株与其它中国分离株均属于Ia亚群。

关键词：猪脑心肌炎病毒基因组同源性比较系统进化分析

猪促炎细胞因子多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国农业大学学报 2012年第2期17卷 117-123页

作者：施开创梁媛陈芳芳屈素洁莫胜兰李军广西动物疫病预防控制中心南宁530001

为建立及应用定量检测猪促炎细胞因子mRNA表达水平的方法,从分子水平研究脑心肌炎病毒(EMCV)的致病机制,分别构建含有猪促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及管家基因β-actin基因片段的重组质粒标准品,建立了检测IL-1β/β-actin、IL... 详细信息

为建立及应用定量检测猪促炎细胞因子mRNA表达水平的方法,从分子水平研究脑心肌炎病毒(EMCV)的致病机制,分别构建含有猪促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及管家基因β-actin基因片段的重组质粒标准品,建立了检测IL-1β/β-actin、IL-6/β-actin、TNF-α/β-actin的多重TaqMan real-time PCR检测方法。标准曲线的相关系数均达到0.998以上;初始模板的检出下限均达到10拷贝/μL;只有以目标cDNA为模板,并加入特异性引物和探针的反应才能检测到荧光信号;组内与组间的变异系数均小于2%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株感染仔猪心肌中IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA的表达水平进行检测。结果表明,所建立的多重TaqMan real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于猪IL-1β、IL-6、TNF-α基因的检测及定量分析。

关键词：猪促炎细胞因子脑心肌炎病毒多重荧光定量RT-PCR TaqMan探针

新城疫病毒和传染性支气管炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2014年第11期36卷 867-871页

作者：屈素洁施开创邹联斌张步娴梁媛莫胜兰粟艳琼胡杰李军广西区动物疫病预防控制中心广西南宁530001

为建立鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的快速鉴别检测方法,本研究根据NDV和IBV的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的Taq Man探针;经过对反应条件的优化,建立了能够同时检测NDV和IBV的双重荧光定... 详细信息

为建立鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的快速鉴别检测方法,本研究根据NDV和IBV的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的Taq Man探针;经过对反应条件的优化,建立了能够同时检测NDV和IBV的双重荧光定量RT-PCR方法。该方法对NDV和IBV的检测灵敏度均为10拷贝/μL,比常规RT-PCR敏感性高100倍;该方法对禽流感病毒、传染性喉气管病病毒、鸡白血病病毒、禽呼肠弧病毒检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性;批内和批间重复变异系数均小于2%。利用所建立的双重荧光定量RT-PCR方法及常规RT-PCR,对185份组织样品进行检测,符合率为100%。该方法可以用于NDV和IBV的快速定量检测。

关键词：新城疫病毒传染性支气管炎病毒双重荧光定量RT-PCR

鸡传染性支气管炎病毒广西株N、M基因的克隆与序列分析

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中国畜牧兽医 2015年第12期42卷 3119-3125页

作者：屈素洁施开创粟艳琼胡杰莫胜兰张步娴李军邹联斌广西动物疫病预防控制中心南宁530001

为研究鸡传染性支气管炎病毒（IBV）广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了1株IBV。参照GenBank中IBV的核苷酸序列设计2对引物,利用RT-PCR技术对分离毒株的N、M基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外... 详细信息

为研究鸡传染性支气管炎病毒（IBV）广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了1株IBV。参照GenBank中IBV的核苷酸序列设计2对引物,利用RT-PCR技术对分离毒株的N、M基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示,N基因序列全长为1 230bp,编码409个氨基酸,M基因序列全长为678bp,编码225个氨基酸。与参考毒株相比,分离株的N基因核苷酸序列同源性为87.2%~93.3%,推导的氨基酸序列同源性为90.0%~94.4%;M基因的核苷酸序列同源性为83.6%~91.0%,推导的氨基酸序列同源性为82.7%~92.9%。在遗传进化树中,本试验分离株Guangxi156株与BJ株和LX4株两个参考株位于同一个分支上,亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远。结果表明,本试验分离株是一株新的IBV变异株。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 N基因 M基因基因克隆序列分析

基于“教—学—评”一体化的初中语文有效教学策略

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天津教育 2024年第8期 153-155页

作者：邹素洁山东省淄博市张店区第三中学

初中语文教师采用“教—学—评”一体化模式开展授课活动,既可以使教、学、评三方实现有效统一,又能更好地提升课程教学效率与质量。对此,为了使一体化教学发挥应有的作用,本文从目标、评价、活动三个视角出发,阐述教师设计一体化授课... 详细信息

初中语文教师采用“教—学—评”一体化模式开展授课活动,既可以使教、学、评三方实现有效统一,又能更好地提升课程教学效率与质量。对此,为了使一体化教学发挥应有的作用,本文从目标、评价、活动三个视角出发,阐述教师设计一体化授课目标、制定一体化评价标准、开展一体化授课活动,最终提高教学质量的具体策略。

关键词：初中语文有效教学策略一体化教学效率与质量教—学—评具体策略一体化模式课程教学

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广西鸭圆环病毒的流行病学调查

黑龙江畜牧兽医 2016年第9期 166-168页

作者：粟艳琼郑敏曹慧慧梁晟张步娴屈素洁莫胜兰广西动物疫病预防控制中心南宁530001 广西大学南宁530000

为了解广西鸭圆环病毒(Du CV)流行情况,试验采用PCR技术对2010—2014年间采自南宁、柳州、桂林等10个城市活禽市场的2 897份临床健康鸭内脏组织样品进行检测,同时对采自83个鸭群的187份发病或死亡鸭组织样品分别进行Du CV、大肠杆菌(E.c... 详细信息

为了解广西鸭圆环病毒(Du CV)流行情况,试验采用PCR技术对2010—2014年间采自南宁、柳州、桂林等10个城市活禽市场的2 897份临床健康鸭内脏组织样品进行检测,同时对采自83个鸭群的187份发病或死亡鸭组织样品分别进行Du CV、大肠杆菌(E.coli)、鸭疫里氏杆菌(RA)、禽流感病毒(AIV)、鸭肝炎病毒(DHV)、副黏病毒(AMPV)、鸭坦布苏病毒(DTUMV)检测。结果表明:10个城市均检测出Du CV阳性样品,其平均检出率为8.01%(232/2 897);187份鸭组织样品中Du CV样品阳性率为20.32%(38/187),其中Du CV单纯感染仅占18.42%(7/38),而二重感染和三重感染的比率分别为50.00%(19/38)和31.58%(12/38)。说明Du CV在广西大部分地区鸭群中呈不同程度的流行,感染率逐年升高,且Du CV感染往往造成其他病原继发感染而引起鸭群发病甚至死亡。

关键词：鸭圆环病毒(DuCV) PCR 流行病学调查阳性率混合感染