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用P. pastoris的pAOX1表达系统表达木糖异构酶

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生物技术 2011年第1期21卷 17-19页

作者：易国辉尹慧祥张爱联海南医学院海南海口571101 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室海南海口571101

目的:应用P. pastoris的pAOX1表达系统分泌表达重组木糖异构酶。方法:用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增木糖异构酶基因(xi)。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切将其基因克隆进P. pastoris表达载体。通过电转法将其木糖异构酶基因重组于P. pastoris基... 详细信息

目的:应用P. pastoris的pAOX1表达系统分泌表达重组木糖异构酶。方法:用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增木糖异构酶基因(xi)。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切将其基因克隆进P. pastoris表达载体。通过电转法将其木糖异构酶基因重组于P. pastoris基因组,筛选G418抗性700μg/ml的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-xi)。在摇瓶中发酵用甲醇诱导表达重组木糖异构酶。用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,用糖酵解法对表达产物进行活性分析。结果:木糖异构酶基因在pAOX1的调控下,在P. pastoris中经甲醇诱导能分泌表达,摇瓶发酵2d表达量为35mg/L,表达产物具有代谢木糖的作用。结论:成功地克隆了大肠杆菌的木糖异构酶基因,并实现用pAOX1系统在P. pastoris中表达中木糖异构酶,为用P. pastoris规模化生产重组木糖异构酶奠定了基础。

关键词：木糖异构酶 P. pastoris pAOX1

斯里兰卡木薯花叶病毒TVM3分离物侵染性克隆构建及鉴定

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广东农业科学 2023年第8期50卷 136-142页

作者：余乃通冼淑丽尹慧祥赵羽涵郑小宝刘志昕中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口571101 海南省热带微生物资源重点实验室海南海口571101 清华大学附属中学文昌学校海南文昌571300

【目的】斯里兰卡木薯花叶病毒(Sri Lankan cassava mosaic virus,SLCMV)是一种对世界木薯产业产生威胁的单链环状DNA病毒,为双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)成员。我国木薯品种抗性不明且抗病种质资源缺乏... 详细信息

【目的】斯里兰卡木薯花叶病毒(Sri Lankan cassava mosaic virus,SLCMV)是一种对世界木薯产业产生威胁的单链环状DNA病毒,为双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)成员。我国木薯品种抗性不明且抗病种质资源缺乏,为进一步探究国内木薯种质资源抗花叶病的遗传背景以及SLCMV与宿主的互作机理,本研究开展SLCMV侵染性克隆构建及鉴定。【方法】以SLCMV(TVM3株系)为对象,将其1.10倍(mer)长的DNA-A和1.08倍(mer)的DNA-B组分分别构建到pCAMBIA1301载体,获得病毒侵染性克隆载体pCAMBIA1301-DNA-A(pDNA-A)和pCAMBIA1301-DNA-B(pDNA-B),利用GV3101农杆菌介导pDNA-A和pDNA-B共侵染本生烟和拟南芥。【结果】SLCMV侵染性克隆接种本生烟14 d后,系统叶可产生严重的花叶、扭曲等症状;而感染SLCMV的拟南芥叶片在18 d出现轻微的扭曲症状。提取感病本生烟和拟南芥植株新生叶片总DNA,PCR方法均检测到了病毒DNA-A和DNA-B组分。此外,本生烟的病毒感染率为100%,而拟南芥的病毒感染率仅为40%,两者差异显著(P<0.05)。【结论】本研究成功构建了SLCMV病毒侵染性克隆,且能侵染本生烟和拟南芥植物,其在本生烟中的病毒感染率高达96.67%;另外,该pDNA-A和pDNA-B侵染性克隆载体序列仅为病毒原基因组DNA-A和DNA-B大小的1.10倍(mer)和1.08倍(mer),且不含有重复的编码区序列,可为下一步探究国内木薯种质资源抗花叶病的遗传背景以及病毒致病机理研究提供重要基础。

关键词：斯里兰卡木薯花叶病毒 DNA病毒侵染性克隆本生烟拟南芥

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一种可降低PCR假阴性的槟榔潜隐病毒检测方法的建立

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分子植物育种 2024年第1期22卷 108-116页

作者：李梦雨尹慧祥羊彬彬汪志伟王健华海南大学园艺学院海南省热带园艺作物品质调控重点实验室海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口571101

为建立一种可降低PCR假阴性的槟榔隐症病毒(areca palm velarivirus 1,APV1)检测方法,参考已报告的槟榔引物保守基因,设计槟榔内标准物引物和APV1引物,槟榔内标准物引物合成3对,APV1引物合成2对,进行PCR扩增筛选槟榔内标准物引物和APV1... 详细信息

为建立一种可降低PCR假阴性的槟榔隐症病毒(areca palm velarivirus 1,APV1)检测方法,参考已报告的槟榔引物保守基因,设计槟榔内标准物引物和APV1引物,槟榔内标准物引物合成3对,APV1引物合成2对,进行PCR扩增筛选槟榔内标准物引物和APV1引物。运用双重PCR扩增方法,优化反应参数。内标准物引物和APV1引物的最适引物浓度比为1:4,内标准物引物终浓度为0.2μmol/L,APV1引物终浓度为0.8μmol/L,最适退火温度为54℃,最适循环次数为30次。灵敏度结果表明,槟榔cDNA浓度稀释到10^(-6)时,仍能扩增出目的条带。特异性结果显示,只有槟榔能检测到内标准物和APV1扩增出的目的条带。利用建立的双重PCR检测方法,对海南省万宁市的40份槟榔样品进行了检测,发现有25份样品感染APV1。本研究结果可为降低槟榔潜隐病毒PCR假阴性提供理论依据。

关键词：槟榔 PCR假阴性内标准物槟榔隐症病毒

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益生菌发酵饲料的研究进展

轻工科技 2018年第5期34卷 35-36,104页

作者：孙海彦吴瑞方包晓东尹慧祥中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口571101

随着国民经济的增长,人们对食品安全性的要求不断提高,同时对环境保护和饲料安全意识的不断增强,开发新型安全饲料成为当务之急。根据前人的研究成果及本人近来的研究收获,本文分别从益生菌发酵饲料的概念、菌种种类和优势、益生菌发酵... 详细信息

随着国民经济的增长,人们对食品安全性的要求不断提高,同时对环境保护和饲料安全意识的不断增强,开发新型安全饲料成为当务之急。根据前人的研究成果及本人近来的研究收获,本文分别从益生菌发酵饲料的概念、菌种种类和优势、益生菌发酵饲料的特点、国内外发展情况及现阶段存在的一些问题进行较为详细的阐述,并对今后益生菌发酵饲料研究方向进行展望,以供相关研究者参考和借鉴。

关键词：益生菌发酵饲料开发利用

用毕赤酵母表达理氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因

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生物技术 2012年第3期22卷 31-33页

作者：林海鹏沈锦城尹慧祥张泽华张爱联中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室海南海口571101 海南大学农学院海南海口570228

目的:为提高β-葡萄糖苷酶的产量,用毕赤酵母取代理氏木霉用于生产,以弥补理氏木霉在大规模生产中的缺陷。方法:用套叠PCR法从理氏木霉基因组中扩增β-葡萄糖苷酶基因(bglⅠ)。用T4DNA连接酶和限制性DNA内酶将bglⅠ重组于***表达载体pPI... 详细信息

目的:为提高β-葡萄糖苷酶的产量,用毕赤酵母取代理氏木霉用于生产,以弥补理氏木霉在大规模生产中的缺陷。方法:用套叠PCR法从理氏木霉基因组中扩增β-葡萄糖苷酶基因(bglⅠ)。用T4DNA连接酶和限制性DNA内酶将bglⅠ重组于***表达载体pPIC9K的多克隆位点,获得含bglⅠ的重组表达载体pPIC9K-bglⅠ。通过电转法将其pPIC9K-bglⅠ载体转化于***基因组,筛选高G418抗性以及高表达bglⅠ酶的重组子作为工程菌。结果:用BMGY-BMMY培养基体系,在摇瓶中发酵48 h,表达BglⅠ30 mg/L,在***中表达的BglⅠ能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷具有β-葡萄糖苷酶活性。其酶活力为56 U/L发酵液。结论:通过这种方法,可以成功地用毕赤酵母表达理氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因。

关键词： β-葡萄糖苷酶毕赤酵母套叠PCR 基因表达酶活力

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斯里兰卡木薯花叶病毒侵染性克隆构建及鉴定

斯里兰卡木薯花叶病毒侵染性克隆构建及鉴定

中国植物病理学会2023年学术年会

作者：冼淑丽尹慧祥赵羽涵郑小宝刘志昕余乃通中国热带农业科学院热带生物技术研究所清华大学附属中学文昌学校海南省热带微生物资源重点实验室

斯里兰卡木薯花叶病毒(Sri Lankan cassava mosaic virus,SLCMV)是一种对世界木薯产业持续威胁的环状单链DNA病毒,含有DNA-A和DNA-B两个组分。本研究以SLCMV(TVM3株系)为对象,将其DNA-A和DNA-B组分分别构建到pCAMBIA1301载体,获得病毒... 详细信息

斯里兰卡木薯花叶病毒(Sri Lankan cassava mosaic virus,SLCMV)是一种对世界木薯产业持续威胁的环状单链DNA病毒,含有DNA-A和DNA-B两个组分。本研究以SLCMV(TVM3株系)为对象,将其DNA-A和DNA-B组分分别构建到pCAMBIA1301载体,获得病毒侵染性克隆载体pCAMBIA1301-DNA-A(pDNA-A)和pCAMBIA1301-DNA-B (pDNA-B)。利用GV3101农杆菌介导pDNA-A和pDNA-B共侵染本生烟和拟南芥,14 d后本生烟系统叶可产生严重的花叶、扭曲等症状;而感染SLCMV的拟南芥叶片在第18天出现轻微的扭曲症状。提取感病烟草和拟南芥新生叶片总DNA,PCR方法均检测到了病毒DNA-A和DNA-B组分。这些结果表明成功构建了SLCMV病毒侵染性克隆,该DNA-A和DNA-B侵染性克隆仅为病毒原基因组大小的1.1倍,且不含有重复的编码区序列,为下一步病毒致病机理研究提供重要前期基础。

关键词：斯里兰卡木薯花叶病毒 DNA病毒侵染性克隆烟草拟南芥

来源： cnki会议评论

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高密度发酵***诱导表达egⅡ基因

工业微生物 2011年第2期41卷 43-46页

作者：尹慧祥易国辉屠发志张添元罗进贤张爱联中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室海口571101 海南大学农学院海口570228 中山大学基因工程教育部重点实验室/生物化学系广州510275

用套叠PCR法扩增里氏木霉(Trichoderma reesei)的葡聚糖内切酶Ⅱ(egⅡ)基因。扩增基因经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后克隆进***表达载体pPIC9k,获得重组表达质粒pPIC9K-egⅡ。通过电转法将egⅡ基因重组于***基因组,筛选高G418抗性的转化子... 详细信息

用套叠PCR法扩增里氏木霉(Trichoderma reesei)的葡聚糖内切酶Ⅱ(egⅡ)基因。扩增基因经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后克隆进***表达载体pPIC9k,获得重组表达质粒pPIC9K-egⅡ。通过电转法将egⅡ基因重组于***基因组,筛选高G418抗性的转化子作为工程菌。工程菌的发酵在生物反应器中进行,在50 L的发酵罐中加入20 L发酵液。连续24 h补加甘油-PTM4增殖细胞,然后以甲醇为碳源诱导egⅡ基因表达48 h。放罐时生物量为A_(600)=203,重组EGⅡ产量为90 mg/L。表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性。

关键词：里氏木霉葡聚糖内切酶基因表达 P.pastoris 高密度发酵

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一株耐盐植物内生真菌的筛选与鉴定

安徽农业科学 2018年第19期46卷 108-110页

作者：孙海彦尹慧祥陈惠琴王琪 Marilyn Roossinck Regina S Redman Rusty Rodriguez 包晓东中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口571011 海南省热带微生物资源重点实验室海南海口571011 宾夕法尼亚州立大学美国16802 华盛顿大学美国98195

[目的]研究盐田原生态系统中的耐盐植物内生真菌。[方法]对38株从海南省莺歌海盐场和东方盐场分离的菌株进行耐盐生长测试。[结果]发现了1株在8%Na Cl浓度下生长较好的真菌,并根据其形态特征,ITS扩增序列聚类进化树分析,显示其分类地位... 详细信息

[目的]研究盐田原生态系统中的耐盐植物内生真菌。[方法]对38株从海南省莺歌海盐场和东方盐场分离的菌株进行耐盐生长测试。[结果]发现了1株在8%Na Cl浓度下生长较好的真菌,并根据其形态特征,ITS扩增序列聚类进化树分析,显示其分类地位为黑酵母菌(Hortaea werneckii)。经过高效液相色谱分析其代谢产物,发现该真菌在0、2%、4%、8%Na Cl浓度下的发酵产物均有所不同。[结论]盐田生境中存在特殊的植物内生真菌区系,其中黑酵母菌Hortaea werneckii具有一定代表性,有深入研究的价值。

关键词：盐田黑酵母聚类进化树高效液相色谱

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饱和土不排水计算理论与方法探究

岩土工程学报 2025年第1期47卷 1-29页

作者：宋二祥清华大学土木水利学院北京100084

饱和土不排水强度及变形计算是岩土工程中颇具难度的复杂课题,至今业内对其多方面的问题仍存争议。结合笔者多年的相关学习研究,对此课题进行了较系统深入的探究。首先讨论了饱和土不排水计算的总应力法与有效应力法及各自的局限,并从... 详细信息

饱和土不排水强度及变形计算是岩土工程中颇具难度的复杂课题,至今业内对其多方面的问题仍存争议。结合笔者多年的相关学习研究,对此课题进行了较系统深入的探究。首先讨论了饱和土不排水计算的总应力法与有效应力法及各自的局限,并从有限元基本方程阐述了孔隙水压的处理,指出不管采用何种方法均应注意区分两类孔隙水压和两种总应力,即“土水分算”。随后,审视了Skempton-Henkel超静水压计算公式对不同应力路径的计算准确性,将它与MC强度准则相结合构建了饱和土不排水强度模型,对等向固结与不等向固结下饱和土不排水强度特性进行了分析,可为实际工程计算中强度参数选取提供参考。建议实际不排水计算采用广义Tresca强度准则,针对采用MC强度准则按有效应力法进行不排水计算会有较大误差的问题,除指出应直接输入不排水强度外,还给出一种采用等代强度参数的处理方法。在上述讨论基础上,剖析了固结不排水强度指标(CU指标)的缺陷,指出仅当土中总应力路径与测定CU指标的试验中相同时,用此指标直接计算才能给出准确的结果,特别是对地基承载力问题直接用此指标计算会给出严重偏危险的结果。还对基坑工程中主动、被动土水压力采用CU指标并土水合算的问题进行了分析,建议了合理计算方法及相应公式;对发生不排水极限土压时的滑移面倾角这一业内多人深感困惑的问题也进行了探讨。最后,针对饱和地基承载力及短期沉降计算,剖析了业内现行方法的问题,在深入解读有关因素影响机理的基础上给出新的计算方法。所给承载力计算公式,可较准确统一计算排水和不排水条件下的承载力,能更好保证设计的安全经济;所给沉降计算新方法能较准确计算饱和地基的短期沉降,对地基的排水沉降也可望取得较好结果,值得进一步发展完善。

关键词：饱和黏性土不排水强度超静水压固结不排水强度指标地基承载力地基沉降