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高产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选、基因克隆与表达

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高产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选、基因克隆与表达

作者：宫路路昆明理工大学

学位级别：硕士

随着人们生活水平提高,牛奶等奶制品逐渐进入人们的饮食生活中。它们为人类提供丰富的蛋白质、维生素以及微量元素,为人类健康提供营养保证。然而,有些人群在饮用牛奶或者奶制品过程中会发生肠鸣、腹胀、腹痛、排气、不适、腹泻等乳糖... 详细信息

随着人们生活水平提高,牛奶等奶制品逐渐进入人们的饮食生活中。它们为人类提供丰富的蛋白质、维生素以及微量元素,为人类健康提供营养保证。然而,有些人群在饮用牛奶或者奶制品过程中会发生肠鸣、腹胀、腹痛、排气、不适、腹泻等乳糖不耐受症症状。由此乳糖不耐受症患者就不能直接食用各类鲜奶制品,为其生活带来诸多不便。一般将乳糖不耐受症分为先天性乳糖不耐受症、原发性乳糖不耐受症(又称成人型β-半乳糖苷酶缺乏)、继发性乳糖不耐受症三类。根据病因不同,其治疗方法也不尽相同。一般采用两种方法治疗乳糖不耐受症,首先是改进饮食习惯,可以通过每天摄入一定量乳糖,并逐步增加乳糖的摄入量,再配合其他不含乳糖食物摄入,这样可以使乳糖不耐受症患者的症状得到一定缓解。其次是生产低乳糖的乳制品,一般采用酶法及机械超滤法去除或破坏牛乳中乳糖。其中第一种方法简单易行,但不能从根本上解决问题;而第二种方法可以避免乳糖的大量摄入,能有效解决乳糖不耐受症。本研究以第二种方法为启迪,寻找能够分解乳糖微生物。一般能够产生β-半乳糖苷酶的微生物均能够降低乳制品中乳糖含量。通过微生物纯培养法结合X-gal实验,筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌。本研究通过基因工程技术手段对β-半乳糖苷酶基因进行克隆与表达,研究其酶学性质以及产酶条件,从而在不同层面探寻解决乳糖不耐受症的方法。本研究以云南省个旧,建水,绿春,红河,元阳,开远等地区采集豆豉样品,运用微生物纯培养技术对样品中乳酸菌进行筛选,同时通过X-gal显色培养, 最终筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌菌株,并且对它们产β-半乳糖苷酶的能力进行判定。通过改良CTAB法提取筛选得到的23株高产β-半乳糖苷酶菌株的基因组DNA,利用PCR技术扩增这些菌株的16SrRNA基因,通过分子生物学鉴定表明,23株产β-半乳糖苷酶菌株分属于Lactobacillus brevis、Pediococcus acidilactici、Lactobacillus plantarum、Enterococcus faecium、Pediococcus pentosaceus、Weissella confusa六个菌种。通过对这些菌株β-半乳糖苷酶活性测定发现,GJ-1-3菌株β-半乳糖苷酶酶活最高,达到5.28 U/mL。经16S rRNA基因鉴定结果表明,该菌株为短乳杆菌(Lb. brevis)。除THU-HA NGUYEN等筛选得到能够产β-半乳糖苷酶的短乳杆菌菌株,但缺乏该种乳酸菌编码β-半乳糖苷酶的相关基因的研究报告,因此本实验通过分子克隆手段对该菌株来源的β-半乳糖苷酶基因进行克隆并实施大肠杆菌的表达研究,最终实现Lb. brevis来源的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌BL21进行异源性表达,酶活达到40 U/mL,比原始菌株提高近7倍。

关键词：豆豉 β-半乳糖苷酶短乳杆菌克隆表达

谷氨酰胺对老年恶性梗阻性黄疸患者可溶性白细胞介素2受体的影响

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中国老年学杂志 2005年第11期25卷 1349-1350页

作者：韩刚宫路路韩喜春吉林大学第二医院基本外科吉林长春130041

目的探讨免疫营养剂谷氨酰胺(G lutam ine,G ln)对老年恶性梗阻性黄疸患者围手术期可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)的影响。方法选择经手术治疗的老年恶性梗阻性黄疸患者30例,随机分为常规治疗组(R组)和谷氨酰胺组(G组)各15例,另取15例... 详细信息

目的探讨免疫营养剂谷氨酰胺(G lutam ine,G ln)对老年恶性梗阻性黄疸患者围手术期可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)的影响。方法选择经手术治疗的老年恶性梗阻性黄疸患者30例,随机分为常规治疗组(R组)和谷氨酰胺组(G组)各15例,另取15例单纯性胆囊炎患者血清作为对照组(C组)。G组于术前1 d至术后7 d每日静脉补充丙氨酸谷氨酰胺注射液100 m l,并分别于术前1 d,术后7、14、21 d采静脉血,采用ELISA法测定血清sIL-2R水平,观察组间的差别。结果R组及G组sIL-2R水平较C组明显升高(P<0.01),术后7d时明显高于术前(P<0.01),G组于术后14 d时sIL-2R水平接近术前,而R组则于术后21 d时达到术前水平,二者21 d时sIL-2R水平差异显著(P<0.01)。结论谷氨酰胺能够降低梗阻性黄疸患者sIL-2R水平,改善机体免疫状态。

关键词：梗阻性黄疸谷氨酰胺可溶性白细胞介素2受体

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硒多糖抗肝细胞癌效应与硫氧还蛋白1的关系

中国老年学杂志 2020年第13期40卷 2870-2872页

作者：张宁邱佳张安龑宫路路遵义医药高等专科学校贵州遵义563000 遵义医科大学第二附属医院

目的探讨硒多糖抗肝细胞癌(HCC)效应与硫氧还蛋白(Trx)-1的关系。方法设置0、50、100、200和400μg/ml共计5组浓度梯度,利用MTT细胞毒活性检测法在细胞水平研究硒多糖对HepG2细胞活力的影响;在分子水平,使用Western印迹检测硒多糖对HepG... 详细信息

目的探讨硒多糖抗肝细胞癌(HCC)效应与硫氧还蛋白(Trx)-1的关系。方法设置0、50、100、200和400μg/ml共计5组浓度梯度,利用MTT细胞毒活性检测法在细胞水平研究硒多糖对HepG2细胞活力的影响;在分子水平,使用Western印迹检测硒多糖对HepG2细胞内Trx-1表达的影响,并进一步检测凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达。结果硒多糖200μg/ml、400μg/ml组的细胞活力较其他浓度显著下降(P<0.05),显著抑制HepG2细胞活性;200μg/ml、400μg/ml组的硒多糖处理使HepG2细胞Trx-1表达量显著降低(P<0.01);凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9的表达量分别在200μg/ml及100μg/ml时开始显著变化(P<0.05)。结论硒多糖可能是通过下调Trx-1的表达诱导HepG2细胞发生凋亡从而抑制HepG2细胞的生长。

关键词：肝细胞癌硒多糖 Trx-1 细胞凋亡

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核桃楸皮提取物对胃癌细胞增殖的影响

中国生物制品学杂志 2010年第3期23卷 294-296页

作者：林瑞新房学东曹宏宫路路陈威彪吉林大学第二医院普通外科长春130041 吉林市龙潭区医院外科吉林吉林132021

目的观察核桃楸皮乙酸乙酯提取物(HYT)对小鼠前胃癌细胞MFC及人正常胃黏膜上皮细胞GES-1增殖的影响。方法从核桃楸皮中提取HYT,以不同浓度作用于MFC和GES-1细胞,MTT法检测HYT对MFC及GES-1细胞增殖的影响;流式细胞术检测MFC细胞周期变化... 详细信息

目的观察核桃楸皮乙酸乙酯提取物(HYT)对小鼠前胃癌细胞MFC及人正常胃黏膜上皮细胞GES-1增殖的影响。方法从核桃楸皮中提取HYT,以不同浓度作用于MFC和GES-1细胞,MTT法检测HYT对MFC及GES-1细胞增殖的影响;流式细胞术检测MFC细胞周期变化及细胞凋亡情况。结果与阴性对照组比较,HYT可明显抑制MFC细胞增殖,促进细胞凋亡,对GES-1细胞无明显杀伤作用;HYT使MFC细胞阻滞于G0-G1和G2-M期。结论HYT可通过影响胃癌细胞周期,促进细胞凋亡,抑制其增殖。

关键词：核桃楸提取物胃癌增殖凋亡

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老年中低位直肠癌前切除术后肛肠功能分析

中国老年学杂志 2007年第22期27卷 2237-2238页

作者：林瑞新杨新宇宫路路房学东黄丞吉林大学普通外科疾病诊疗中心吉林长春130041 大庆油田总院普通外科长春市绿园区中医院普通外科

遵循TME理念的低位前切除术及吻合器的广泛采用，保肛手术已成为中低位直肠癌患者的常规术式。Nakahara等研究发现，所有中低位直肠癌患者行前切除术后均有肠道功能紊乱和频繁排便等症状，患者生活质量较差，而通过肛肠功能测定明确老... 详细信息

遵循TME理念的低位前切除术及吻合器的广泛采用，保肛手术已成为中低位直肠癌患者的常规术式。Nakahara等研究发现，所有中低位直肠癌患者行前切除术后均有肠道功能紊乱和频繁排便等症状，患者生活质量较差，而通过肛肠功能测定明确老年中低位直肠癌患者术后肠道功能的报道较少。本文从着重观察老年直肠癌患者术前及术后肠道功能变化，从而为进一步研究老年直肠癌患者术后排便功能紊乱的机制及制定相应治疗对策提供资料。

关键词：直肠癌前切除术肛肠测压

凯里地区辣椒酸细菌群落多样性及其乳酸菌分离鉴定

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中国酿造 2021年第11期40卷 98-103页

作者：李洁崔霖芸陈芳勇宫路路遵义医药高等专科学校医学技术系贵州遵义563000

利用Illumina MiSeq高通量测序技术对凯里地区辣椒酸中细菌群落多样性进行研究,并结合传统纯培养技术对样品中乳酸菌进行分离鉴定。结果显示,样品中优势细菌门为厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),相对含量分别为77.9%和1... 详细信息

利用Illumina MiSeq高通量测序技术对凯里地区辣椒酸中细菌群落多样性进行研究,并结合传统纯培养技术对样品中乳酸菌进行分离鉴定。结果显示,样品中优势细菌门为厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),相对含量分别为77.9%和19.59%;优势细菌属为乳酸杆菌(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacterales)、Lelliottia、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas),相对含量分别为72.02%、5.59%、3.97%、5.30%、1.64%、1.07%和1.02%。同时,采用纯培养技术从辣椒酸中分离出了43株细菌,其中34株被鉴定为乳酸杆菌,6株为芽孢杆菌,3株为葡萄球菌。由此可见,乳酸杆菌为凯里地区辣椒酸中的优势细菌,且主要为植物乳杆菌;同时分离出了葡萄球菌,提示传统发酵辣椒酸存在一定的食品安全风险,应引起重视。

关键词：辣椒酸高通量测序细菌多样性乳酸菌

大肠埃希菌β-半乳糖苷酶重组菌株的筛选和培养条件研究

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中国病原生物学杂志 2019年第8期14卷 870-874页

作者：宫路路柳陈坚张宁李洁遵义医药高等专科学校贵州遵义563000 昆明理工大学生命科学与技术学院应用微生物研究室

目的筛选含有目的基因E. coli BL21/pET28a-bgaB-18(以下简称18号重组菌株)的β-半乳糖苷酶重组菌株并对其产酶条件进行优化。方法采用Kan琼脂平板培养基筛选和菌落PCR验证,得到整合短乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的重组大肠埃希菌菌株。通... 详细信息

目的筛选含有目的基因E. coli BL21/pET28a-bgaB-18(以下简称18号重组菌株)的β-半乳糖苷酶重组菌株并对其产酶条件进行优化。方法采用Kan琼脂平板培养基筛选和菌落PCR验证,得到整合短乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的重组大肠埃希菌菌株。通过改变碳源、氮源的种类及其浓度,结合改变IPTG诱导剂浓度、重组菌株培养时间,摇床培养振荡速度等多种因素,在不同条件下采用液体振荡培养法培养重组大肠埃希菌。收集培养的重组菌液经离心后超声破碎,取上清液,测定重组菌株破碎细胞上清液酶活性,并根据酶活大小确定培养条件。结果筛选得到1株稳定表达β-半乳糖苷酶基因的重组菌株E. coli BL21/pET28a-bgaB-18。通过测定不同培养条件下破碎细胞上清液酶活性,确定该重组菌株最佳培养条件为:碳源为蔗糖,浓度7.0%;氮源为酵母粉,浓度2.0%;培养时间为7 h,诱导剂IPTG浓度为1.5 mg/ml,摇床转速为220 r/min。经优化的条件培养的重组菌酶活达156.2 U/ml,较诱导前酶活性为16.5 U/ml,提高约8.5倍。结论重组菌E. coli BL21/pET28a-bgaB-18在适宜碳源、氮源种类、浓度,IPTG浓度及培养时间条件下能稳定表达β-半乳糖苷酶,在食品和乳品加工等方面具有较好的应用前景。

关键词：大肠埃希菌 β-半乳糖苷酶短乳杆菌重组菌株诱导表达培养条件

桥本甲状腺炎和甲状腺乳头状癌miRNAs表达差异研究

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中国地方病防治 2015年第3期30卷 223-224页

作者：张亚伟宫路路赵鹏贾明库吉林大学第二医院肝胆外科吉林长春130041

微小RNA是一类广泛存在于真核生物中非编码单链小RNA分子,通过降解靶基因mRNA或抑制其蛋白翻译,参与调控人体一系列重要生理病理过程。1资料与方法1.1组织样本采集选择2014年5月-2014年12月在吉林大学第二医院行甲状腺切除术的患者6名... 详细信息

微小RNA是一类广泛存在于真核生物中非编码单链小RNA分子,通过降解靶基因mRNA或抑制其蛋白翻译,参与调控人体一系列重要生理病理过程。1资料与方法1.1组织样本采集选择2014年5月-2014年12月在吉林大学第二医院行甲状腺切除术的患者6名。男性2例,女性4例。其中HT患者3例（男性1例,女性2例）;PTC患者3例（男性1例,女性2例）。

关键词： miRNAs 甲状腺乳头状癌甲状腺切除术桥本甲状腺炎差异研究生理病理样本采集真核生物正常甲状腺甲状腺组织

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胃肠癌淋巴结转移机制的研究

中国普通外科杂志 2011年第4期20卷 417-419页

作者：任辉宫路路曲日初房学东吉林大学普通外科疾病诊疗中心吉林大学第二医院普通外科吉林长春130041

近年来对于胃肠癌淋巴转移机制的研究成为热点,笔者对胃肠癌区域淋巴结转移的机制及与淋巴转移的关系进行综述,着重在以下方面:肿瘤细胞从原发肿瘤部位转移到区域淋巴结的解剖通路、在区域淋巴结转移中淋巴管生成的重要性,以及在肿瘤细... 详细信息

近年来对于胃肠癌淋巴转移机制的研究成为热点,笔者对胃肠癌区域淋巴结转移的机制及与淋巴转移的关系进行综述,着重在以下方面:肿瘤细胞从原发肿瘤部位转移到区域淋巴结的解剖通路、在区域淋巴结转移中淋巴管生成的重要性,以及在肿瘤细胞定向迁移过程中趋化因子受体的作用。

关键词：胃肠肿瘤淋巴结肿瘤转移综述文献