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RNA-Seq挖掘黄绿卷毛菇中核黄素合成途径差异表达基因

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分子植物育种 2024年第1期22卷 77-84页

作者：刘峰曹东宗渊李云魏乐刘宝龙青海师范大学生命科学学院西宁810008 中国科学院西北高原生物研究所青海省作物分子育种重点实验室西宁810001

为探究黄绿卷毛菇和双孢蘑菇的基因表达差异,挖掘黄绿卷毛菇核黄素合成途径的主效基因,本研究利用RNA-Seq技术对黄绿卷毛菇和双孢蘑菇进行二代转录组测序与生物信息学分析。结果表明,黄绿卷毛菇和双孢蘑菇中共检测到26 818个基因差异表... 详细信息

为探究黄绿卷毛菇和双孢蘑菇的基因表达差异,挖掘黄绿卷毛菇核黄素合成途径的主效基因,本研究利用RNA-Seq技术对黄绿卷毛菇和双孢蘑菇进行二代转录组测序与生物信息学分析。结果表明,黄绿卷毛菇和双孢蘑菇中共检测到26 818个基因差异表达,其中11 236个基因在黄绿卷毛菇中表达上调,15 582个基因表达下调。KEGG富集结果显示,共有19 988个差异表达基因参与植物次生代谢产物合成,其中在维生素代谢途径中有813个差异表达基因。在核黄素代谢通路中,黄绿卷毛菇和双孢蘑菇中共有5个参与核黄素合成代谢的结构基因没有产生差异表达,有6个在黄绿卷毛菇中呈现不同程度上调。核黄素转运蛋白MCH5的同源基因CL911.Contig3_ALL(Almch5)在黄绿卷毛菇中特异表达,log_(2)FC值高达12.98,同时Almch5与斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)中核黄素转运蛋白MCH5高度同源,都具有相似的7bp3.1A转运蛋白功能域,表明Almch5可能是转运黄绿卷毛菇中核黄素的主效蛋白,这为黄绿卷毛菇中核黄素合成机制研究提供了新线索。

关键词：黄绿卷毛菇双孢蘑菇差异表达核黄素

基于Tail-PCR分析AN2基因上游启动子活性

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热带亚热带植物学报 2023年

作者：宗渊韦国石光禹刘宝龙包雪梅中国科学院青海省作物分子育种重点实验室中国科学院华南植物园广东省应用植物学重点实验室中国科学院华南农业植物分子分析与遗传改良重点实验室青海师范大学教育学院

黑果枸杞(Lycium ruthenicum)富含花青素，AN2基因是调控黑果枸杞花青素合成代谢的主效基因。为解析AN2基因启动子的活性差异，采用Tail-PCR方法分别克隆了黑果枸杞和红果枸杞(L. barbarum) AN2基因起始密码子上游约1 686 bp (LrAN2p)和... 详细信息

黑果枸杞(Lycium ruthenicum)富含花青素，AN2基因是调控黑果枸杞花青素合成代谢的主效基因。为解析AN2基因启动子的活性差异，采用Tail-PCR方法分别克隆了黑果枸杞和红果枸杞(L. barbarum) AN2基因起始密码子上游约1 686 bp (LrAN2p)和1 495 bp (LbAN2p)的序列。Plant CARE预测表明，LbAN2p和LrAN2p中分别有133和137个的顺式作用元件，其中，参与光调控的顺式元件分别有11和15个；参与激素响应相关的顺式元件分别有13和16个。构建AN2启动子植物表达载体pKGWFS7:LbAN2p和pKGWFS7:LrAN2p，利用农杆菌介导的烟草遗传转化体系获得转基因烟草。GUS染色结果表明，LrAN2p能够驱动GUS在烟草中的表达，叶片呈现蓝色，具有较LbAN2p更强的启动活性，qRT-PCR结果表明，LrAN2p转基因烟草中GUS基因具有更高的转录水平，这可能会使AN2基因在黑果枸杞中具有更高的表达，激活黑果枸杞花青素合成代谢通路。这为解析枸杞果色形成及AN2基因的表达调控机制奠定了理论基础。

关键词：黑果枸杞花青素 AN2 启动子 GUS染色

转录组学挖掘黑果枸杞中花青素生物合成代谢关键bHLH调控基因

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分子植物育种 2023年第6期21卷 1864-1873页

作者：包雪梅胡娜宗渊王洪伦中国科学院西北高原生物研究所中国科学院藏药研究重点实验室西宁810001 中国科学院西北高原生物研究所青海省作物分子育种重点实验室西宁810001 青海师范大学教育学院西宁810016 中国科学院大学北京100049

黑果枸杞果实中富含花青素,为探究黑果枸杞和白果枸杞的基因表达差异,挖掘控制黑果枸杞黑果性状的主效基因,本研究利用RNA-Seq技术对黑果枸杞和白果枸杞进行转录组测序与生物信息学分析。结果表明,黑果枸杞和白果枸杞中共检测到25 279... 详细信息

黑果枸杞果实中富含花青素,为探究黑果枸杞和白果枸杞的基因表达差异,挖掘控制黑果枸杞黑果性状的主效基因,本研究利用RNA-Seq技术对黑果枸杞和白果枸杞进行转录组测序与生物信息学分析。结果表明,黑果枸杞和白果枸杞中共检测到25 279个基因差异表达,其中12 381个基因在黑果枸杞表达上调,12 898个基因表达下调。KEGG富集结果显示,共有571个差异表达基因参与植物次生代谢产物合成,尤其是在黄酮类和花青素生物合成代谢通路中差异最为明显。黑果枸杞中共有8个参与花青素合成代谢的结构基因的表达量均高于白果枸杞,说明花青素的生物合成可能与黑果枸杞黑果性状相关。调控花青素生物合成的bHLH转录因子CL8159.Contig5_All的表达水平比白果枸杞增强了2 139.57倍,这个基因很有可能是控制黑果枸杞黑果性状的候选基因。本研究筛选到控制黑果枸杞花青素合成代谢的候选基因,为黑果枸杞的分子遗传机理及进一步的基因功能研究提供了依据。

关键词：黑果枸杞白果枸杞差异表达花青素

西伯利亚白刺NsMYB5调控果实花青素生物合成

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西北农业学报 2023年第8期32卷 1215-1222页

作者：包雪梅宗渊胡娜刘宝龙王洪伦中国科学院藏药研究重点实验室西北高原生物研究所西宁810008 青海师范大学西宁810008 中国科学院大学北京100049 青海省作物分子育种重点实验室西宁810008

基于西伯利亚白刺红果、黑果果皮转录组数据,本研究筛选并克隆获得一个与西伯利亚白刺果实花青素和原花青素合成代谢相关的R2R3-MYB转录因子,命名为NsMYB5。该基因ORF为840 bp,编码279个氨基酸,NsMYB5具有完整的SANT、MYB domain及HLH-M... 详细信息

基于西伯利亚白刺红果、黑果果皮转录组数据,本研究筛选并克隆获得一个与西伯利亚白刺果实花青素和原花青素合成代谢相关的R2R3-MYB转录因子,命名为NsMYB5。该基因ORF为840 bp,编码279个氨基酸,NsMYB5具有完整的SANT、MYB domain及HLH-MYB domain结构域,属于R2R3-MYB转录因子,与调控花青素和原花青素合成相关的香雪兰FhMYB5同源性较高。过表达NsMYB5烟草花瓣和雄蕊积累大量花青素,呈现深紫色,而叶片和茎仅有少量花青素积累,局部呈现淡紫色。转基因株系中花的花青素和原花青素含量均显著高于野生型(P<0.05)。结果表明,NsMYB5可以正向调控花青素和原花青素的合成,这为西伯利亚白刺果实果皮呈色的分子遗传机理提供了理论依据。

关键词：西伯利亚白刺 NsMYB5 花青素原花青素

病毒介导CRISPR/Cas9烟草基因编辑系统的研究

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病毒介导CRISPR/Cas9烟草基因编辑系统的研究

作者：宗渊青海师范大学

学位级别：硕士

基因组编辑是利用序列特异核酸酶在基因组特定位点产生DNA双链断裂,激活细胞自身的修复机制(非同源末端连接或同源重组),实现基因敲除、染色体重组以及基因定点插入或替换的技术。当有外源DNA或者病毒入侵,CRISPR/Cas系统会将入侵的序... 详细信息

基因组编辑是利用序列特异核酸酶在基因组特定位点产生DNA双链断裂,激活细胞自身的修复机制(非同源末端连接或同源重组),实现基因敲除、染色体重组以及基因定点插入或替换的技术。当有外源DNA或者病毒入侵,CRISPR/Cas系统会将入侵的序列片段整合进去,由特定的crRNA进行同源序列的降解。该系统构建简单、精准度高、成本低、能同时对多个位点进行定点编辑。本研究探索了利用豌豆早褐病毒介导CRISPR/Cas9系统的关键因子crRNA和Cas9蛋白在烟草中表达,期望实现对烟草基因进行编辑。主要结果如下:1、设计烟草PDS基因的目标编辑序列,设计引物扩增,酶切,与酶切后的pCAPE2-GFP连接获得pCAPE2:crRNA载体。利用农杆菌转化的方法获得遍在表达Cas9蛋白的转基因系。将pCAPE1和pCAPE2:crRNA质粒转化农杆菌GV3101,把包含pCAPE1和pCAPE2:Cas9-crRNA质粒的农杆菌1:1混合后侵染遍在表达Cas9蛋白的转基因系,但未能发现基因组编辑表型。2、获得烟草的crRNA序列。通过扩增得到Cas9片段,将载体和两个片段各自酶切,通过T4连接酶对该三片段进行连接,获得pCAPE2:Cas9-crRNA载体。将pCAPE1和pCAPE2:Cas9-crRNA,分别转化农杆菌GV3101,把包含pCAPE1和pCAPE2:Cas9-crRNA质粒的农杆菌1:1混合后侵染烟草品种Samsun。注射后2-3周,在烟草的新生叶片上出现了板块化的失绿,说明整合了Cas9和crRNA片段的pCAPE1和pCAPE2能够侵染烟草,并能实现扩增。对失绿的烟草叶片区域取样后,提取基因组DNA,设计特异引物扩增烟草PDS基因区域,扩增后的片段连接到pGEM-Teasy载体,通过对基因组测序后发现,PDS基因未能发生编辑。分析后发现所用的烟草品种Samsun的PDS基因与所设计的CRISPR/cas9系统的Target序列有几个碱基的差异。3、获取烟草的配子特异表达基因NtDMC1,将其构建进表达载体中,利用Gateway技术将Cas9蛋白构建到该载体中,获得pH7WG:NtDMC1:Cas9载体。论文构建PEBV介导的CRISPR/Cas9基因组编辑的载体pCAPE2:Cas9-crRNA和PEBV介导的crRNA表达的载体pCAPE2:crRNA,获得了遍在表达Cas9蛋白的烟草转基因系,克隆烟草配子特异表达基因NtDMC1的启动子,构建了Cas9配子特异表达载体pH7WG:NtDMC1:Cas9,证明了PEBV能够介导crRNA和Cas9蛋白能在烟草中扩增,为RNA病毒介导CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中的应用打下良好基础。

关键词：基因组编辑 CRISPR/Cas9 烟草 PDS

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播种密度对青海省饲用小黑麦生产性能的影响

分子植物育种 2022年第13期20卷 4495-4505页

作者：王东霞韩民王伟李春喜宗渊曹东刘宝龙青海大学农牧学院青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室西宁810006 青海省农业农村厅西宁810008 青海省畜牧兽医科学院西宁810016 中国科学院西北高原生物研究所青海省作物分子育种重点实验室西宁810008

为了探究不同播种密度对青海省不同海拔生态区3个饲用小黑麦品系群体动态、灌浆期株高和草产量、收获期草产量等生产性能的影响,本试验设3个播种密度(3.00×10^(6)株/hm^(2),3.75×10^(6)株/hm^(2),4.50×10^(6)株/hm^(2)),3个不同海拔... 详细信息

为了探究不同播种密度对青海省不同海拔生态区3个饲用小黑麦品系群体动态、灌浆期株高和草产量、收获期草产量等生产性能的影响,本试验设3个播种密度(3.00×10^(6)株/hm^(2),3.75×10^(6)株/hm^(2),4.50×10^(6)株/hm^(2)),3个不同海拔生态区(乐都生态区,2 016 m;湟中生态区,2 630 m;同德生态区,3 251 m)和3个自育品系(ZHS2,ZHS1,GY197)。对各播种密度下不同生态区3个小黑麦品系的生育期、群体动态、草产量、穗部性状、籽粒产量和经济系数等指标进行测定,并对其差异进行分析。结果表明,种植密度对饲用小黑麦生产性能影响较大,在乐都生态区品系ZHS2的分蘖成穗率、鲜草产量和干草产量、籽粒成熟期干草重、籽粒产量和经济系数等指标在播种密度为4.50×10^(6)株/hm^(2)时达最大值;湟中生态区,品系ZHS2的分蘖成穗率、鲜草产量和干草产量、籽粒产量等指标在播种密度为4.50×10^(6)株/hm^(2)时最大;同德生态区,自育品系ZHS2的田间出苗率、鲜草产量和干草产量在播种密度为4.50×10^(6)株/hm^(2)时最大。结合TOPSIS综合分析结果可得,在各生态区,品系ZHS2的播种密度为4.50×10^(6)株/hm^(2)时,综合生产性能最佳。本研究可为青海农牧交错区小黑麦高效栽培技术探究提供理论依据。

关键词：小黑麦生态区生产性能种植密度

沙鞭转录因子PvCBF1的基因克隆及功能验证

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基因组学与应用生物学 2022年第9期41卷 1985-1996页

作者：刘峰苏旭宗渊刘宝龙李云张雨刘涛袁园刘玉萍青海师范大学生命科学学院西宁810008 中国科学院西北高原生物研究所青海省作物分子育种重点实验室西宁810001 青海师范大学高原科学与可持续发展研究院西宁810016 青海师范大学地理科学学院西宁810008

沙鞭(Psammochloa villosa)是西北地区重要的防风固沙植物,关于其耐旱调控基因克隆与功能验证的研究尚未见报道。基于三代转录组测序技术,本研究克隆出沙鞭中调控耐旱的关键转录因子PvCBF1基因,对其编码产物的理化性质、蛋白质结构特点... 详细信息

沙鞭(Psammochloa villosa)是西北地区重要的防风固沙植物,关于其耐旱调控基因克隆与功能验证的研究尚未见报道。基于三代转录组测序技术,本研究克隆出沙鞭中调控耐旱的关键转录因子PvCBF1基因,对其编码产物的理化性质、蛋白质结构特点和进化关系进行了分析,测定了其在沙鞭不同组织及模拟干旱胁迫条件下的表达,并验证了PvCBF1在转基因烟草(Nicotiana tabacum)中的功能。结果表明,PvCBF1基因编码区长度为690 bp,编码229个氨基酸,包括AP2保守结构域,并含有CBF转录因子的两段特征序列PKRPAGRTKFRETRHP和DSAWR;进化分析显示,沙鞭PvCBF1与普通小麦(Triticum aestivum)CBF1转录因子亲缘最近;RT-qPCR结果表明,PvCBF1基因在沙鞭根、茎、叶和种子中均能表达,无组织表达特异性;模拟干旱胁迫0~6 h,PvCBF1基因迅速表达并在6 h时达到峰值;20%PEG-6000模拟干旱胁迫条件下,随模拟干旱胁迫时间的增加,转PvCBF1基因烟草叶片萎蔫程度明显低于野生型烟草,转PvCBF1基因烟草和野生型烟草的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性逐渐升高,并且转PvCBF1基因烟草的抗氧化酶活性高于野生型烟草的(P<0.05)。此外,转基因型烟草的抗氧化酶活性随模拟干旱胁迫时间的增加而升高,而野生型烟草的抗氧化酶活性呈现先升高后降低的趋势。这些结果表明PvCBF1基因可能参与了沙鞭的耐旱响应生理过程,为今后进一步探讨PvCBF1基因响应沙鞭的耐旱分子机制提供了理论依据。

关键词：沙鞭 PvCBF1转录因子克隆干旱胁迫功能验证

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青海黄绿卷毛菇中核黄素的分离与鉴定

分子植物育种 2023年第19期21卷 6539-6546页

作者：刘峰刘宝龙宗渊李云曹东刘玉萍魏乐青海师范大学生命科学学院西宁810008 中国科学院西北高原生物研究所青海省作物分子育种重点实验室西宁810001

为了探究黄绿卷毛菇黄色表型的主要化合物成分以及进一步合理开发利用,本研究以黄绿卷毛菇为试验材料,通过水提取法得到核黄素提取物,经高效液相色谱检测发现,在480 nm可见光下提取物于9.728 min时出现的目的峰与核黄素标准品(VB_(2))于... 详细信息

为了探究黄绿卷毛菇黄色表型的主要化合物成分以及进一步合理开发利用,本研究以黄绿卷毛菇为试验材料,通过水提取法得到核黄素提取物,经高效液相色谱检测发现,在480 nm可见光下提取物于9.728 min时出现的目的峰与核黄素标准品(VB_(2))于9.758 min出现的目的峰可能为同一种物质。根据上述9.728 min目的峰制备所有核黄素提取物,经浓缩干燥后得到核黄素制备品1.18 g,纯度为98.4%。对其进行质谱检测发现在3个特征离子[M+H]^(+)m/z377.1->172.0、[M+H]^(+)m/z377.1->198.0、[M+H]^(+)m/z377.1->243.0条件下核黄素制备品与标准品出峰时间非常相近,并且核黄素制备品的^(1)H-NMR和^(13)C-NMR数据与核黄素标准品相似度高,分子式为C_(17)H_(20)N_(4)O_(6),可以确定该化合物为核黄素。本研究结果将为黄绿卷毛菇营养价值评价、品系培育研究以及进一步开发利用提供参考。

关键词：黄绿卷毛菇核黄素高效液相色谱质谱核磁共振

普通小麦中TaMYC1基因启动子的克隆和功能分析

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分子植物育种 2022年第8期20卷 2456-2462页

作者：罗香怡宗渊曹东甘晓龙李云刘宝龙魏乐青海师范大学生命科学学院西宁810008 青海大学农牧学院西宁810016 中国科学院青海省作物分子育种重点实验室西宁810001

花青素在植物生长发育和调节外界胁迫中发挥重要作用,TaMYC1是调控小麦四倍体紫色果皮花青素合成主效基因Pp3的候选基因。本研究对TaMYC1启动子的活性进行差异分析,结果表明TaMYC1w的弱活性是导致TaMYC1基因在白粒小麦中无法诱导花青素... 详细信息

花青素在植物生长发育和调节外界胁迫中发挥重要作用,TaMYC1是调控小麦四倍体紫色果皮花青素合成主效基因Pp3的候选基因。本研究对TaMYC1启动子的活性进行差异分析,结果表明TaMYC1w的弱活性是导致TaMYC1基因在白粒小麦中无法诱导花青素的原因之一。从紫粒小麦GY115和白粒小麦Opata分离到TaMYC1p启动子和TaMYC1w启动子,分别为3198和2186 bp。构建TaMYC1启动子植物表达载体TaMYC1p:GUS和TaMYC1w:GUS并转入本氏烟草发现TaMYC1启动子能够驱动GUS基因在烟草表皮中的表达,且TaMYC1p启动子在烟草表皮中表达量明显高于TaMYC1w,说明TaMYC1p启动子的活性要远高于TaMYC1w,这可能就是紫粒小麦中TaMYC1转录水平较高,并能够诱导激活花青素合成代谢通路的原因之一。本研究对TaMYC1p和TaMYC1w启动子进行生物信息学分析以及转基因过表达验证等分子生物学实验,为后续有色小麦花青素生物合成代谢研究提供可靠的分子理论基础。

关键词：紫粒小麦花青素 TaMYC1 启动子