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3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体文库高通量筛选方法的建立

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生物技术 2024年第2期 158-164页

作者：董新林胡青何建新吕德强宋士奎苏正定湖北工业大学生物工程与食品学院发酵工程教育部重点实验室

[目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KstD）突变体库的方法。[方法]基于已发表KstD蛋白晶体结构，设计饱和突变引物，构建突变体文库，优化蛋白表达条件，利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液；基于分光光度法原理，优化... 详细信息

[目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KstD）突变体库的方法。[方法]基于已发表KstD蛋白晶体结构，设计饱和突变引物，构建突变体文库，优化蛋白表达条件，利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液；基于分光光度法原理，优化检测反应体系，利用酶标仪检测吸光度的变化来反映酶活力。[结果]利用饱和突变引物成功构建突变体文库，表达KstD最佳条件为：IPTG终浓度0.3 mmol/L,20℃诱导20 h;缓冲液中溶菌酶浓度为0.5 mg/mL时上清目的蛋白含量最高。优化后的酶活检测条件为：Tris-HCl缓冲液50 mmol/L、pH 8.0、0.4 mmol/L DCPIP、1.5 mmol/L PMS、0.7 mmol/L雄烯二酮（4AD）和适量的酶液组成，温度30℃、酶反应时间5 min,于600 nm波长下测定。[结论]成功建立了一种5 min检测96个3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KstD）突变体的高通量筛选方法，重复性变异系数在3%以下。

关键词： 3-甾酮-Δ1-脱氢酶定点饱和突变高通量筛选半理性设计雄烯二酮酶标仪酶法脱氢突变体文库

3-甾酮-Δ-脱氢酶突变体文库高通量筛选方法的建立

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生物技术 2024年 158-164页

作者：董新林胡青何建新吕德强宋士奎苏正定湖北工业大学生物工程与食品学院发酵工程教育部重点实验室

[目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-Δ1-脱氢酶(Kst D)突变体库的方法。[方法]基于已发表Kst D蛋白晶体结构，设计饱和突变引物，构建突变体文库，优化蛋白表达条件，利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液;基于分光光度法原理，优化检... 详细信息

[目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-Δ1-脱氢酶(Kst D)突变体库的方法。[方法]基于已发表Kst D蛋白晶体结构，设计饱和突变引物，构建突变体文库，优化蛋白表达条件，利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液;基于分光光度法原理，优化检测反应体系，利用酶标仪检测吸光度的变化来反映酶活力。[结果]利用饱和突变引物成功构建突变体文库，表达Kst D最佳条件为:IPTG终浓度0.3 mmol/L,20℃诱导20 h;缓冲液中溶菌酶浓度为0.5 mg/m L时上清目的蛋白含量最高。优化后的酶活检测条件为:Tris-HCl缓冲液50 mmol/L、p H 8.0、0.4 mmol/L DCPIP、1.5 mmol/L PMS、0.7 mmol/L雄烯二酮(4AD)和适量的酶液组成，温度30℃、酶反应时间5 min，于600 nm波长下测定。[结论]成功建立了一种5 min检测96个3-甾酮-Δ1-脱氢酶(Kst D)突变体的高通量筛选方法，重复性变异系数在3%以下。

关键词： 3-甾酮-Δ -脱氢酶定点饱和突变高通量筛选半理性设计雄烯二酮酶标仪酶法脱氢突变体文库

3-甾酮-Δ-脱氢酶突变体文库高通量筛选方法的建立

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生物技术 2024年

作者：董新林胡青何建新吕德强宋士奎苏正定湖北工业大学生物工程与食品学院发酵工程教育部重点实验室

[目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KstD)突变体库的方法。[方法]基于已发表Kst D蛋白晶体结构,设计饱和突变引物,构建突变体文库,优化蛋白表达条件,利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液;基于分光光度法原理,优化检测反应... 详细信息

[目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KstD)突变体库的方法。[方法]基于已发表Kst D蛋白晶体结构,设计饱和突变引物,构建突变体文库,优化蛋白表达条件,利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液;基于分光光度法原理,优化检测反应体系,利用酶标仪检测吸光度的变化来反映酶活力。[结果]利用饱和突变引物成功构建突变体文库,表达Kst D最佳条件为:IPTG终浓度0.3 mmol/L,20℃诱导20 h;缓冲液中溶菌酶浓度为0.5 mg/m L时上清目的蛋白含量最高。优化后的酶活检测条件为:Tris-HCl缓冲液50 mmol/L、 pH 8.0、0.4 mmol/L DCPIP、1.5 mmol/L PMS、0.7 mmol/L雄烯二酮(4AD)和适量的酶液组成,温度30℃、酶反应时间5 min,于600 nm波长下测定。[结论]成功建立了一种5 min检测96个3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KstD)突变体的高通量筛选方法,重复性变异系数在3%以下。

关键词： 3-甾酮-Δ -脱氢酶定点饱和突变高通量筛选半理性设计雄烯二酮酶标仪酶法脱氢突变体文库

以分枝杆菌为底盘细胞生物合成甾药中间体的研究进展

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生物工程学报 2023年第3期39卷 1056-1069页

作者：宋士奎何建新黄永棋苏正定湖北工业大学生物工程与食品学院湖北武汉430068 工业发酵教育部重点实验室和湖北省工业微生物重点实验室湖北武汉430068

甾体药物(steroid drugs)是一类具有重要生理和药理作用的药物。目前,甾药行业主要通过分枝杆菌(Mycobacteria)转化制备系列重要甾药中间体,再经过必要的化学修饰或酶法修饰获得高端甾体药物。较之前的“薯蓣皂素-双烯醇酮”体系具有原... 详细信息

甾体药物(steroid drugs)是一类具有重要生理和药理作用的药物。目前,甾药行业主要通过分枝杆菌(Mycobacteria)转化制备系列重要甾药中间体,再经过必要的化学修饰或酶法修饰获得高端甾体药物。较之前的“薯蓣皂素-双烯醇酮”体系具有原料廉价且来源丰富、生产成本低且反应路线短、收率高且环境友好等优点。基于基因组学和代谢组学进一步揭示分枝杆菌甾醇降解途径中关键酶系及其催化机理,使分枝杆菌作为底盘细胞成为可能。本文对不同物种类固醇转化酶的发现、分枝杆菌自源基因和异源基因过表达的改造以及分枝杆菌作为底盘细胞的优化和修饰等方面的研究进展进行了综述。

关键词：分枝杆菌底盘细胞生物转化甾体药物

分枝杆菌HGMS2甾醇降解中新C-23代谢产物的鉴定及其代谢途径分析

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生物工程学报 2023年第11期39卷 4550-4562页

作者：何建新董新林黄永棋宋士奎苏正定湖北工业大学生物工程与食品学院湖北武汉430068 工业发酵教育部重点实验室湖北省工业微生物重点实验室湖北武汉430068

新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)通过敲除羟酰基辅酶A脱氢酶(hydroxyacyl-CoA dehydrogenase,Hsd4A)或酰基辅酶A硫解酶(acyl-CoAthiolase,FadA5)基因来生产22-羟基-23,24-双降甾-4-烯-3-酮(22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-en-3-one,BA)甾体类药物中间体来受到广泛关注。本实验室前期发现,敲除fadA5基因后,发酵产物中出现了一种新的代谢产物。本研究通过对该物质的结构鉴定、fadA5基因的蛋白同源序列比对、M.neoaurumHGMS2的系统发育树分析和基因敲除等手段探究该物质的代谢途径。结果表明该物质为C23类代谢中间体,即24-norchol-4-ene-3,22-dione(将其命名为3-OPD)。该物质是通过硫酯酶(thioesterase,TE)催化3,22-dioxo-25,26-bisnorchol-4-ene-24-oylCoA(22-O-BNC-CoA)生成侧链为β-酮酸结构的物质后通过生物体的自动脱羧反应生成的。这些结果对开发新的甾类中间体有重要价值。

关键词：甾体药物 fadA5 基因敲除新金分枝杆菌 C-23代谢中间体

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GLP-1R激动剂及正变构调节剂研究进展

中国医院药学杂志 2023年第21期43卷 2453-2458页

作者：王芮杨紫鑫宋士奎柯志强苏正定湖北工业大学工业发酵省部共建协同创新中心湖北武汉430068 武汉艾默佳华生物科技有限公司湖北武汉430075 湖北科技学院咸宁医学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室湖北咸宁437100

胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R)是治疗2型糖尿病的重要靶标,作为一种G蛋白偶联受体可通过胰高血糖素样肽-1介导胰岛素分泌。该文对胰高血糖素样肽-1和GLP-1R的结构与功能进行综述,并对肽类GLP-1R激动... 详细信息

胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R)是治疗2型糖尿病的重要靶标,作为一种G蛋白偶联受体可通过胰高血糖素样肽-1介导胰岛素分泌。该文对胰高血糖素样肽-1和GLP-1R的结构与功能进行综述,并对肽类GLP-1R激动剂、非肽类小分子GLP-1R激动剂和GLP-1R正变构调节剂的设计开发进行讨论,旨在为进一步探寻2型糖尿病的治疗方案提供思路。

关键词：胰高血糖素样肽-1 胰高血糖素样肽-1受体肽类GLP-1R激动剂小分子GLP-1R激动剂 GLP-1R正变构调节剂

新月弯孢霉转录组分析及甾体Cβ-羟化酶基因鉴定

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生物技术 2023年 537-543页

作者：明卓宋士奎苏正定湖北工业大学生物工程与食品学院

[目的]分析新月弯孢霉转录组，对甾体C11β-羟基化酶基因进行鉴定。[方法]结合生物信息学和蛋白结构学对转录组分析，利用AlphaFold2进行蛋白结构模拟，与已知人源醛固酮合酶hCYP11B 2进行结构比对。[结果]在转录组中，共获得24 943条Un... 详细信息

[目的]分析新月弯孢霉转录组，对甾体C11β-羟基化酶基因进行鉴定。[方法]结合生物信息学和蛋白结构学对转录组分析，利用AlphaFold2进行蛋白结构模拟，与已知人源醛固酮合酶hCYP11B 2进行结构比对。[结果]在转录组中，共获得24 943条Unigenes，平均长度1 915 bp。18 792(75.34%)条可以匹配到蛋白数据库获得注释信息。Unigenes在各数据库中注释的基因数分别为:在COG数据库中有5 615 (22.51%)条，在GO数据库中有4 424条(17.74%)，在KEGG数据库中有6 322条(25.35%)，在Swiss-Prot数据库中有11 348条(45.50%)。通过初筛获得39个基因。经过AlphaFold2的结构模拟，与人的甾体醛固酮合酶(hCYP11B2)结构比对进行复筛，共26条甾体C11β-羟基化酶相关基因被鉴定出来。[结论]该新月弯孢霉菌株具有甾体C11β-羟基化的能力，通过对其转录组进行分析，共鉴定出26条甾体C11β-羟基化酶相关基因。

关键词：新月弯孢霉甾体C β-羟基化酶转录组结构比对生物信息学分析

新月弯孢霉转录组分析及甾体C11β-羟化酶基因鉴定

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生物技术 2023年第5期33卷 537-543页

作者：明卓宋士奎苏正定湖北工业大学生物工程与食品学院

[目的]分析新月弯孢霉转录组，对甾体C11β-羟基化酶基因进行鉴定。[方法]结合生物信息学和蛋白结构学对转录组分析，利用AlphaFold2进行蛋白结构模拟，与已知人源醛固酮合酶hCYP11B 2进行结构比对。[结果]在转录组中，共获得24 943条Unigenes,平均长度1 915 bp。18 792条(75.34%)可以匹配到蛋白数据库获得注释信息。Unigenes在各数据库中注释的基因数分别为：在COG数据库中有5 615条(22.51%),在GO数据库中有4 424条(17.74%),在KEGG数据库中有6 322条(25.35%),在Swiss-Prot数据库中有11 348条(45.50%)。通过初筛获得39个基因。经过AlphaFold2的结构模拟，与人的甾体醛固酮合酶(hCYP11B2)结构比对进行复筛，共26条甾体C11β-羟基化酶相关基因被鉴定出来。[结论]该新月弯孢霉菌株具有甾体C11β-羟基化的能力，通过对其转录组进行分析，共鉴定出26条甾体C11β-羟基化酶相关基因。

关键词：新月弯孢霉甾体C11β-羟基化酶转录组结构比对生物信息学分析

分枝杆菌HGMS2中类固醇C20-羟基脱氢酶的鉴定

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工业微生物 2023年第4期53卷 170-178页

作者：明卓胡青宋士奎苏正定国家细胞调控与分子药物“111”引智基地湖北武汉430068 发酵工程教育部重点实验室湖北武汉430068 湖北工业大学生物工程与食品学院湖北武汉430068

分枝杆菌常被用作甾体药物中间体生产菌种,然而当前人们对其具体的甾醇降解机制仍然不是很清楚。为了获得C20-羟基甾药中间体,文章直接以RS为底物进行了转化,并通过对转化产物进行TLC、HPLC、LS-MS和核磁分析,初步确定分枝杆菌中存在类... 详细信息

分枝杆菌常被用作甾体药物中间体生产菌种,然而当前人们对其具体的甾醇降解机制仍然不是很清楚。为了获得C20-羟基甾药中间体,文章直接以RS为底物进行了转化,并通过对转化产物进行TLC、HPLC、LS-MS和核磁分析,初步确定分枝杆菌中存在类固醇C20-羟基脱氢酶(1DHC)参与的代谢途径。同时,基于生物信息学和结构生物学,通过序列和结构比对分析,最终从分枝杆菌中鉴定出了一个与类固醇C20-羟基脱氢酶同源性很高的基因。将该基因在大肠杆菌中异源表达,并对其功能活性进行分析,证明该基因所编码的酶和类固醇C20-羟基脱氢酶具有相同的功能活性。文章首次从分枝杆菌中鉴定出一种类固醇C20-羟基脱氢酶,使研究者对分枝杆菌甾醇代谢机制有了更深入的理解,同时也为新型甾药中间体的制备以及分枝杆菌的改造奠定了理论基础。

关键词：分枝杆菌类固醇C20β-羟基脱氢酶产物分析 17α-羟基-孕甾-4-烯-3 20-二酮