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E3泛素连接酶TRIM21抗乙型肝炎病毒复制的作用及分子机制

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E3泛素连接酶TRIM21抗乙型肝炎病毒复制的作用及分子机制

作者：宋亚惠苏州大学

学位级别：硕士

[背景]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染人体诱导急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎及肝硬化、肝纤维化和肝细胞癌,仍然是世界上最严重的公共健康问题之一。我国每年新发乙肝感染者仍有百万之巨,而现有乙肝治疗药物如核苷酸类似物、... 详细信息

[背景]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染人体诱导急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎及肝硬化、肝纤维化和肝细胞癌,仍然是世界上最严重的公共健康问题之一。我国每年新发乙肝感染者仍有百万之巨,而现有乙肝治疗药物如核苷酸类似物、干扰素等,不能完全清除病毒,寻找新的乙肝病毒抑制剂或相关分子靶点显得十分迫切。三重基序蛋白(Tripartite motif protein,TRIM)家族成员TRIM21具有E3泛素连接酶活性,参与多种细胞生理功能,在病毒感染过程中发挥正向调控干扰素通路抗病毒和负向调控干扰素通路促进病毒复制的双重功能。有报道显示TRIM21通过其胞浆IgFc受体功能间接抑制HBV复制,但仍不清楚TRIM21是否具有直接抑制HBV复制的功能。[目的]探究TRIM21在肝细胞内HBV复制过程中发挥的作用及其分子机制。[方法]***感染肝细胞模型:以1μg pUC19-HBV1.3质粒转染肝癌细胞系Huh7和HepG2,48 h后逆转录定量PCR检测HBV复制中间体HBV RNA、ELISA检测上清包膜蛋白s抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)证实感染。2.建立体内瞬时HBV感染小鼠模型:通过高压尾静脉快速注射10 μg的pUC19-HBV1.3质粒至小鼠,4天后肝细胞可测HBV RNA表达,血清可测HBeAg和HBsAg蛋白的分泌,肝脏可原位检测HBc抗原表达。3.敲低和过表达TRIM21:肝癌细胞转染p-Flag-TRIM21可上调TRIM21的表达,转染TRIM21特异性siRNA可敲低内源性TRIM21表达。***21结构域缺失体质粒的构建:酶切连接法分别构建TRIM21的ΔRING、ΔB-BOX、ΔPRY/SPRY缺失突变体质粒。***21的抗HBV复制活性检测:TRIM21的各种表达质粒与pUC19-HBV1.3共转HepG2细胞,48 h后逆转录定量PCR检测复制中间体HBV RNA;ELISA检测上清HBeAg和HBsAg水平;绝对定量PCR检测上清HBV DNA水平;巢式PCR检测细胞中HBV Precore-core DNA水平。6.免疫共沉淀筛选与TRIM21互作的HBV蛋白:将带Myc标签的HBV蛋白质粒p-HBx、p-HBs、p-HBc或空载质粒分别与p-Flag-TRIM21共转HEK293T细胞,48 h进行SDS-PAGE,以Flag抗体明确与TRIM21互作的HBV蛋白。7.泛素-蛋白酶体途径降解病毒蛋白实验:p-Flag-TRIM21与p-Myc-HBx共转HEK293T 细胞,48 h 后检测 HBx 表达。p-Flag-TRIM21 与 p-Myc-HBx 和 HA-总泛素化质粒共转HEK293T,48 h后,蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞4 h,以抗Myc-HBx抗体进行免疫共沉淀,Western blot检测泛素化修饰的改变。8.构建TRIM21瞬时过表达小鼠和TRIM21敲除小鼠:C57雌性小鼠通过高压尾静脉注射20μg/只p-Flag-mTRIM21,验证TRIM21在小鼠体内过表达。由南京生物医药研究院构建TRIM21杂合子敲除小鼠,杂交得到TRIM21纯合子敲除小鼠。9.乙肝小鼠体内检测TRIM21对HBV的直接抑制功能:将p-Flag-mTRIM21与pUC19-HBV1.3高压尾静脉注射C57小鼠,或pUC19-HBV1.3注射TRIM21-KO和WT小鼠,4天后检测血清HBeAg和HBsAg水平;qRT-PCR检测肝脏HBV RNA水平;免疫组化检测肝脏HBcAg和HBxAg的表达。[结果]***感染肝细胞显著上调TRIM21的表达:在HBV细胞模型中,证实HBV感染肝细胞诱导TRIM21在mRNA水平和蛋白水平的显著上调表达。***21可显著抑制肝细胞内HBV的复制与表达:Huh7和HepG2中,过表达TRIM21均可显著抑制HBV RNA和HBeAg、HBsAg的表达。而以siRNA下调TRIM21则可显著增加HBV RNA和HBeAg、HBsAg水平。***21的抗病毒效应依赖于RING结构域:TRIM21的RING和PRY-SPRY结构域缺失体阻断了 TRIM21的抗HBV作用。***21与HBx之间相互作用:免疫共沉淀实验证实TRIM21可与HBx蛋白之间存在强相互作用,与HBc之间存在弱相互作用,而与HBs之间不存在相互作用。免疫荧光实验证实TRIM21与HBx确实存在相互作用。***21通过泛素-蛋白酶体途径降解HBx蛋白:HEK293T细胞中,共转TRIM21可直接下调HBx蛋白水平,而对HBc表达无影响;MG132处理可逆转HBx表达。泛素实验证实TRIM21可促进HBx上发生的泛素化

关键词：乙型肝炎病毒 TRIM21 HBx 泛素化降解

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酶解法提取韭菜籽蛋白及抗氧化活性的研究

食品工业 2016年第1期37卷 11-16页

作者：尹国友孙婕郑高攀陈卓宋亚惠河南城建学院生命科学与工程学院平顶山467036

以脱脂韭菜籽粉为原料,采用纤维素酶酶解法提取韭菜籽蛋白。以韭菜籽蛋白得率为指标,考察酶含量、料液比、提取时间及提取温度对得率的影响。在单因素试验的基础上,采用响应面分析法确定韭菜籽蛋白提取工艺,同时建立韭菜籽蛋白质提取的... 详细信息

以脱脂韭菜籽粉为原料,采用纤维素酶酶解法提取韭菜籽蛋白。以韭菜籽蛋白得率为指标,考察酶含量、料液比、提取时间及提取温度对得率的影响。在单因素试验的基础上,采用响应面分析法确定韭菜籽蛋白提取工艺,同时建立韭菜籽蛋白质提取的二次项数学模型并验证其可靠性。以酶含量、料液比、提取时间及提取温度为自变量,探讨这4个因素交互作用和最佳提取条件,并对其进行验证。试验结果表明:影响韭菜籽蛋白提取工艺的因素主次顺序为:料液比>提取温度>酶含量>提取时间。韭菜籽蛋白质提取的最佳工艺条件:酶含量0.75%,料液比1︰6(g/m L),提取时间3.0 h,提取温度51℃,得率为15.141 9%。在韭菜籽蛋白质量浓度为2.0 mg/m L时,对·OH和DPPH·清除率分别为49.3%和61.3%,表明采用纤维素酶酶解法制备得到的韭菜籽蛋白具有抗氧化活性。

关键词：韭菜籽蛋白酶解法提取抗氧化活性

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复合氨基酸螯合钙质量及补钙效果分析

中国公共卫生 2021年第6期37卷 974-977页

作者：宋佳乐刘国凤焦奎宋亚惠王尚龙曹廷锋于佳魏玉西青岛大学生命科学学院山东青岛266071 青岛市妇女儿童医院青岛琛蓝医药科技发展有限公司

目的以栉孔扇贝加工副产物为原料,制备复合氨基酸螯合钙,旨在获得安全稳定的新型补钙剂,实现栉孔扇贝加工副产物的高值化利用。方法通过重金属等有害物质检测、傅里叶红外光谱表征和体外胃肠消化系统模拟进行复合氨基酸螯合钙质量和稳... 详细信息

目的以栉孔扇贝加工副产物为原料,制备复合氨基酸螯合钙,旨在获得安全稳定的新型补钙剂,实现栉孔扇贝加工副产物的高值化利用。方法通过重金属等有害物质检测、傅里叶红外光谱表征和体外胃肠消化系统模拟进行复合氨基酸螯合钙质量和稳定性分析;采用动物试验测定内脏指数、血清生化、骨密度等指标,评价复合氨基酸螯合钙的补钙功能。结果复合氨基酸螯合钙质量指标符合相关标准要求,安全稳定,易于吸收且利用率高,其钙离子表观吸收率可达(81.83±8.48)%,保留率可达(81.37±5.53)%,并可显著提高骨密度(P<0.05),达到补钙效果。结论以栉孔扇贝加工副产物为原料制备的复合氨基酸螯合钙是一种潜在的高效补钙剂。

关键词：复合氨基酸螯合钙质量分析稳定性补钙效果钙代谢

迈向自主法学知识体系的比较法研究范式——以2003-2022年的比较法论文为样本

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法学研究 2024年第1期46卷 19-38页

作者：宋亚辉南京大学法学院

比较法在当代中国的兴起源于服务立法之使命,随着中国特色社会主义法律体系的逐步形成,比较法也在转型发展。以介绍和比较域外法为论题的“显性比较法”逐渐式微,借助比较法上的论据探讨本国问题的“隐性比较法”渐成主流;比较对象的选... 详细信息

比较法在当代中国的兴起源于服务立法之使命,随着中国特色社会主义法律体系的逐步形成,比较法也在转型发展。以介绍和比较域外法为论题的“显性比较法”逐渐式微,借助比较法上的论据探讨本国问题的“隐性比较法”渐成主流;比较对象的选取日益受本国法体系约束,具有家族相似性的域外法愈发受青睐。这两个发展趋势寓意深远。由于法律问题往往深嵌于本土社会,问题的社会语境因此成为隐性比较法研究的制约因素;如果说社会语境只是一种软约束的话,本国法体系则是一种更为直接的硬约束。这两个约束条件不仅塑造了比较法的研究目标,而且限定了比较对象的选择,同时也影响了比较分析的方法和域外法素材的应用方式。这整体上构成了隐性比较法颇具中国特质的研究范式,其中蕴含着比较法学主体意识回归的积极信号。主体意识的回归是构建自主法学知识体系的关键所在,总体上契合了中国法治的发展进程。

关键词：比较法法律移植法系范式转型自主法学知识体系

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以贝壳为钙源的焦谷氨酸钙抗疲劳功效研究

中国海洋药物 2020年第3期39卷 64-70页

作者：李焱高翔王平贵宋佳乐宋亚惠王尚龙魏玉西青岛大学生命科学学院山东青岛266071 琛蓝(美国)国际有限公司加利福尼亚州因维92614

目的验证1种新型补钙剂--焦谷氨酸钙(calcium L-pyroglutamate,CAP)的抗疲劳作用。方法选取正常雄性昆明小鼠作为实验动物,腹腔注射脂多糖形成炎症模型,随机分组并通过观察小鼠负重游泳时间,血清尿素氮(BUN)、乳酸(LA)水平,血清乳酸脱氢... 详细信息

目的验证1种新型补钙剂--焦谷氨酸钙(calcium L-pyroglutamate,CAP)的抗疲劳作用。方法选取正常雄性昆明小鼠作为实验动物,腹腔注射脂多糖形成炎症模型,随机分组并通过观察小鼠负重游泳时间,血清尿素氮(BUN)、乳酸(LA)水平,血清乳酸脱氢酶(LDH)活性,血清肿瘤坏死因子α(TNF-α),白介素10(IL^-10)、白介素1β(IL^-1β),肝糖原、肌糖原以及肌肉组织中丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)活性,综合评价焦谷氨酸钙的抗疲劳作用。结果与模型组相比,高、低剂量组小鼠负重游泳时间显著延长(P<0.05或P<0.01),焦谷氨酸钙高剂量组BUN水平显著下降(P<0.05),血清LA水平显著下降,血清LDH活性显著提升,血清TNF-α,IL^-1β浓度显著降低,IL^-10浓度显著提高,肝、肌糖原含量显著升高,肌肉SOD活性显著升高,MDA含量显著下降。结论焦谷氨酸钙具有显著抗疲劳效果,其作用机制可能与调节能量代谢,抗氧化应激活性以及抗炎症活性有关,可以作为1种潜在的抗疲劳药物。

关键词：焦谷氨酸钙抗疲劳炎症抗氧化

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自主游戏中幼儿园教师有效支持策略研究

自主游戏中幼儿园教师有效支持策略研究

作者：宋亚雯海南师范大学

学位级别：硕士

从《史记》看西汉“是”与“此”语法功能的异同

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湖北大学学报（哲学社会科学版） 2024年第3期51卷 97-105,F0003页

作者：宋亚云北京大学中文系北京100871

在《史记》的统计语料中,“是”有形容词、系词、指示代词,“是”和“此”有指示代词作主语、宾语、定语等六个方面的功能。观察“是”和“此”的这些功能,可以看出:“是”可以充当形容词、系词,充当指示代词作谓语,而“此”都不能;“... 详细信息

在《史记》的统计语料中,“是”有形容词、系词、指示代词,“是”和“此”有指示代词作主语、宾语、定语等六个方面的功能。观察“是”和“此”的这些功能,可以看出:“是”可以充当形容词、系词,充当指示代词作谓语,而“此”都不能;“此”的指代性比“是”要强;“此”和“是”作主语时,都可以后接谓词性谓语,但“是”后接谓词性谓语占绝对优势;“此”作动词宾语、定语的比例则均高于“是”。系词“是”的形成可能与其指示代词和形容词用法都有关系,而“此”不具备形容词用法,因此不能发展为系词。

关键词： “是” “此” 《史记》语法功能

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中医病证诊断疗效标准·原发性痛经（修订）

中华中医药杂志 2024年第4期 1884-1887页

作者：梁潇宋亚静《中医病证诊断疗效标准·原发性痛经》项目组河北中医药大学

原发性痛经是妇科常见病、多发病，中医治疗特色鲜明，疗效确切。《中医病证诊断疗效标准》（ZY/T001.1—94）由国家中医药管理局于1994年批准发布，已二十余年未修订。本次修订基于循证医学证据并采用系统评价的研究方法确定证据等级... 详细信息

原发性痛经是妇科常见病、多发病，中医治疗特色鲜明，疗效确切。《中医病证诊断疗效标准》（ZY/T001.1—94）由国家中医药管理局于1994年批准发布，已二十余年未修订。本次修订基于循证医学证据并采用系统评价的研究方法确定证据等级和推荐强度，并通过2轮德尔菲法专家调查问卷形成专家共识，在此基础上起草《中医病证诊断疗效标准·原发性痛经（修订）》，以期为中医药开展诊治原发性痛经的临床及研究工作建立标准化体系。

关键词：原发性痛经中医诊疗标准专家共识法循证医学

基于生成对抗网络的完全随机缺失数据插补研究

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基于生成对抗网络的完全随机缺失数据插补研究

作者：宋亚琳山西财经大学

学位级别：硕士