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点突变Pro229Ser和Glu243Gly对耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶性质的影响

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Acta Genetica Sinica 2001年第3期28卷 278-284页

作者：姜涛季朝能盛小禹毛裕民复旦大学生命科学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

采用ＰＣＲ随机诱变方法，研究氨基酸置换对耐热邻苯二酚２，３－双加氧酶性质的影响。比较分析了突变体Ｐｒｏ２２９Ｓｅｒ和Ｇｌｕ２４３Ｇｌｙ与野生型酶的酶学性质。结果显示点突变Ｐｒｏ２２９→Ｓｅｒ或Ｇｌｕ２４３→Ｇｌｙ并... 详细信息

采用ＰＣＲ随机诱变方法，研究氨基酸置换对耐热邻苯二酚２，３－双加氧酶性质的影响。比较分析了突变体Ｐｒｏ２２９Ｓｅｒ和Ｇｌｕ２４３Ｇｌｙ与野生型酶的酶学性质。结果显示点突变Ｐｒｏ２２９→Ｓｅｒ或Ｇｌｕ２４３→Ｇｌｙ并未改变酶的最适反应温度（均为６０℃）；突变体Ｐｒｏ２２９Ｓｅｒ（Ｋｃａｔ／Ｋｍ＝４．８９ ± ０．０１ × １０６ｍｏｌ－１ｓ－１）以及突变体Ｇｌｕ２４３Ｇｌｙ（Ｋｃａｔ／Ｋｍ＝５．８８±０．０１× １０６ｍｏｌ－１ｓ－１）的催化能力与野生型酶（Ｋｃａｔ／Ｋｍ＝６．９７±０．０１× １０６ｍｏｌ－１ｓ－１）相比有所下降；点突变Ｐｒｏ２２９→Ｓｅｒ大幅度降低了酶的热稳定性（△Ｔｍ≈ １０．２℃），而点突变Ｇｌｕ２４３－Ｇｌｙ对酶的热稳定性影响较小（△Ｔｍ≈１．５℃）。推测Ｐｒｏ２２９对耐热邻苯二酚２，３－双加氧酶的热稳定性有重要贡献。

关键词：随机诱变热稳定性耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶蛋白质

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交河故城古车师人的线粒体DNA分析

高等学校化学学报 2002年第8期23卷 1510-1514页

作者：崔银秋段然慧季朝能朱泓李惟毛裕民周慧复旦大学遗传工程国家重点实验室吉林大学生命科学学院考古DNA实验室长春130023 吉林大学生命科学学院考古DNA实验室

从距今 2 0 0 0～ 2 5 0 0年左右的交河故城古代人骨中提取古 DNA,用 4对重叠引物对线粒体基因组的调控区 (3 63 bp)进行了扩增及测序 .线粒体基因组编码区的扩增片段用于限制性片段多样性分析 .结果显示4个个体中具有 3个 DNA序列 ,其... 详细信息

从距今 2 0 0 0～ 2 5 0 0年左右的交河故城古代人骨中提取古 DNA,用 4对重叠引物对线粒体基因组的调控区 (3 63 bp)进行了扩增及测序 .线粒体基因组编码区的扩增片段用于限制性片段多样性分析 .结果显示4个个体中具有 3个 DNA序列 ,其中来自不同墓穴的两个个体的序列相同 ,说明这两者间有密切的母系遗传关系 .系统发育分析表明古车师的这 4个个体分散分布在现代新疆维吾尔人的序列之中 .从这些结果可以初步得出结论 ,即古车师人群并不是一个同源群体 ,在早期铁器时代。

关键词：交河矿城古车师人线粒体 DNA 测序限制性片段多样性分析系统发育分析古人类学

人类多效生长因子(Pleiotrophin)的全基因合成、原核表达与纯化

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生物技术通报 2012年第7期28卷 103-107页

作者：马兰季朝能复旦大学生命科学学院遗传学研究所上海200433

PTN作为重要的细胞因子,存在于多种生物体内,参与多种生物学过程,具有刺激细胞增殖、分化、粘附、迁移等多种功能。根据PTN的基因序列及大肠杆菌密码子的偏爱性,人工合成ptn基因,构建pMAL-his-sumo-ptn重组表达载体,将重组表达载体转化... 详细信息

PTN作为重要的细胞因子,存在于多种生物体内,参与多种生物学过程,具有刺激细胞增殖、分化、粘附、迁移等多种功能。根据PTN的基因序列及大肠杆菌密码子的偏爱性,人工合成ptn基因,构建pMAL-his-sumo-ptn重组表达载体,将重组表达载体转化到***(Rosetta)中并进行优化表达。融合蛋白在0.4 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导3 h表达量最高。收集菌体、纯化、酶切、SDS-PAGE可检测到分子量为18 kD左右的重组蛋白。

关键词：人类多效生长因子基因密码子优化全基因合成原核表达融合蛋白

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耐热碱性磷酸酯酶的功能结构域的定位

中国生物化学与分子生物学报 2001年第1期17卷 80-84页

作者：季朝能盛小禹姜涛金 毛裕民复旦大学生命科学学院遗传所上海200433

为了确定耐热碱性磷酸酯酶 (TAPND2 7)发挥活性所必需的功能结构域 ,通过 PCR介导的诱变缺失 ,得到了 N端分别缺失 8、1 6、2 5个氨基酸的 3个缺失体 p TAPN8、p TAPN1 6和p TAPN2 5以及 C端分别缺失 1 0和 30个氨基酸的两个缺失体 p TA... 详细信息

为了确定耐热碱性磷酸酯酶 (TAPND2 7)发挥活性所必需的功能结构域 ,通过 PCR介导的诱变缺失 ,得到了 N端分别缺失 8、1 6、2 5个氨基酸的 3个缺失体 p TAPN8、p TAPN1 6和p TAPN2 5以及 C端分别缺失 1 0和 30个氨基酸的两个缺失体 p TAPC1 0和 p TAPC30 .经表达和活性测定 ,发现 p TAPN8和 TAPC1 0保持了较高的活性而其余 3个缺失体则失去酶活性 .据此 ,TAPND2 7的活性区域被定位在 8～ 465氨基酸之间 .在分离纯化的基础上测定了一些酶学性质 .发现 TAPN8和 TAPC1 0的比活没有大的改变 ,Tm 下降了 5.5℃ ;TAPN8的最适反应温度上升了1 0℃ .结果提示了 N端和 C端的这些氨基酸残基对热稳定性有一定的贡献 ,N端氨基酸残基还对酶的亲热性有贡献 .

关键词：耐热碱性磷酸酯酶功能结构域定位热稳定性

甲硫氨酸合成酶还原酶基因多态性与肿瘤易感性关系的Meta分析

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复旦学报（自然科学版） 2009年第5期48卷 640-647页

作者：余科顾少华谢毅毛裕民季朝能复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

利用Meta分析方法系统性的评价甲硫氨酸合成酶还原酶基因（MTRR）A66G多态性与肿瘤易感性的关系.通过文献检索,收集国内外相关的病例对照研究文献,并对符合条件的研究结果进行Meta分析,包括亚组分析、敏感性检验,异质性检验,发表偏倚评... 详细信息

利用Meta分析方法系统性的评价甲硫氨酸合成酶还原酶基因（MTRR）A66G多态性与肿瘤易感性的关系.通过文献检索,收集国内外相关的病例对照研究文献,并对符合条件的研究结果进行Meta分析,包括亚组分析、敏感性检验,异质性检验,发表偏倚评估.最终纳入25篇文献,总共38项独立研究,累计13 901例肿瘤患者和20 385例对照个体.Meta分析结果显示,MTRR基因A66G多态性G等位基因能显著性提高肿瘤易感性（OR,1.05;P=0.006;95%CI,1.011.08;Pheterogeneity=0.193）.敏感性分析表明此关联不受单个研究或单种肿瘤的影响,说明了结果的可靠性.亚组分析和Meta回归分析揭示人群起源和研究设计都不是异质性来源,只有肿瘤类型是异质性来源.因此MTRR基因可能是肿瘤的一个易感微效基因,尤其对于淋巴细胞白血病和脑膜瘤.

关键词： MTRR 肿瘤基因多态性 Meta分析

林肯链霉菌林肯变种谷氨酰胺合成酶的研究(英文)

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复旦学报（自然科学版） 1999年第4期38卷 428-434页

作者：金詟张双全季朝能毛裕民复旦大学南京师范大学

林肯链霉菌林肯变种是林可霉素的产生菌，研究中发现其菌丝体中谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）的比活力与林可霉素的生物合成存在正相关性．在此基础上，报道了ＧＳ的分离纯化、分子特征、酶学性质和活力调节特性．采用硫酸铵分级沉淀、Ｄ... 详细信息

林肯链霉菌林肯变种是林可霉素的产生菌，研究中发现其菌丝体中谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）的比活力与林可霉素的生物合成存在正相关性．在此基础上，报道了ＧＳ的分离纯化、分子特征、酶学性质和活力调节特性．采用硫酸铵分级沉淀、ＤＥ５２离子交换层析、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ凝胶过滤等方法，从林肯链霉菌林肯变种中分离纯化了ＧＳ，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）鉴定为单一组分．以梯度ＰＡＧＥ和凝胶过滤法测得ＧＳ的相对分子质量为６６００００，ＳＤＳ ＰＡＧＥ测得其亚基相对分子质量为５５０００，表明该酶由１２个相同的亚基构成．Ｍｇ２＋或Ｍｎ２＋作为辅助因子对ＧＳ的催化活性是必需的．反馈抑制是ＧＳ的一种重要调节方式，这种抑制作用是以累积的方式进行的，这表明各种代谢物对ＧＳ的作用位点不同，它们对ＧＳ的抑制作用是相互独立的．以受腺苷化去腺苷化调节的产气克雷伯氏菌ＧＳ作对照，研究发现林肯链霉菌林肯变种ＧＳ没有明显的氨休克作用，且经蛇毒磷酸二酯酶处理后，其活力没有变化．这些结果都说明林肯链霉菌林肯变种ＧＳ不存在腺苷化共价修饰这一调节方式．另外，对不同氮源生长条件下林肯链霉菌林肯变种无细?

关键词：林肯链霉菌林肯变种谷氨酰胺合成酶林可霉素

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人红细胞带3蛋白胞质段的克隆及其表达

生物化学与生物物理进展 1999年第5期26卷 492-494页

作者：李至彭锋季朝能宦春雷张志鸿复旦大学生命科学学院立人实验室上海200433

人红细胞带３蛋白胞质段（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｄｏｍａｉｎｏｆｂａｎｄ３，ｃｄｂ３）起着将膜与膜骨架、细胞内环境相联系的重要作用．以带３蛋白全长基因为模板，用ＰＣＲ方法扩增出ｃｄｂ３片段，克隆至ｐＲＳＥＴ表... 详细信息

人红细胞带３蛋白胞质段（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｄｏｍａｉｎｏｆｂａｎｄ３，ｃｄｂ３）起着将膜与膜骨架、细胞内环境相联系的重要作用．以带３蛋白全长基因为模板，用ＰＣＲ方法扩增出ｃｄｂ３片段，克隆至ｐＲＳＥＴ表达质粒上，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）．转化菌经诱导表达出较高含量的ｃｄｂ３蛋白，纯化后，

关键词：带3蛋白胞质段质粒表达红细胞

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无机磷酸盐对耐热碱性磷酸酶耐热性的影响

中国生物化学与分子生物学报 2001年第4期17卷 506-509页

作者：白晓阳季朝能姜涛盛小禹毛裕民复旦大学生命科学学院遗传学研究所上海200433

为研究体外磷酸根离子对嗜热菌 (Thermussp .30 4 1)碱性磷酸酶TAPND2 7耐热性的影响 ,通过克隆于高表达质粒上编码TAPND2 7的基因在E .coli中的诱导表达和蛋白产物的纯化 ,获得了电泳纯的TAPND2 7.耐热性实验表明磷酸根离子能显著提高... 详细信息

为研究体外磷酸根离子对嗜热菌 (Thermussp .30 4 1)碱性磷酸酶TAPND2 7耐热性的影响 ,通过克隆于高表达质粒上编码TAPND2 7的基因在E .coli中的诱导表达和蛋白产物的纯化 ,获得了电泳纯的TAPND2 7.耐热性实验表明磷酸根离子能显著提高该酶的热稳定性 ,在 10mmol L磷酸根离子存在下 ,TAPND2 7的Tm 值从 91℃上升到了 97℃ ;酶的动力学实验证实无机磷酸盐 (Pi)对TAP ND2 7的酶活性有可逆竞争性抑制作用 ,Ki 值为 0 99× 10 -4 mol L .上述结果说明 ,TAPND2 7耐热性的提高是由于磷酸根离子对TAPND2 7活性位点的竞争性结合 ,这种结合 ,推测为Pi 与氨基酸残基间的非共价相互作用 ,减小了TAPND2 7的自由能。

关键词：耐热碱性磷酸酶磷酸盐热稳定性

结核杆菌enoyl-酰基载体蛋白还原酶与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作用的测定

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中华传染病杂志 2003年第4期21卷 253-255页

作者：陈澍张文宏季朝能邵凌云翁心华复旦大学附属华山医院传染病教研室上海200040 复旦大学遗传所国家重点实验室

目的　了解enoyl 酰基载体蛋白还原酶 (inhA)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)的作用 ,建立量化两者的作用强度方法。方法　对结核杆菌H3 7Rv的inhA进行克隆、表达并以Nit NTASuperflow亲和柱纯化表达产物 ,然后将 0 .8mg/ml的inhA蛋白与 ... 详细信息

目的　了解enoyl 酰基载体蛋白还原酶 (inhA)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)的作用 ,建立量化两者的作用强度方法。方法　对结核杆菌H3 7Rv的inhA进行克隆、表达并以Nit NTASuperflow亲和柱纯化表达产物 ,然后将 0 .8mg/ml的inhA蛋白与 1mmol/L的NADH室温作用 10min后 ,以分光光度法在 2 0 0～ 40 0nm范围连续扫描作用前后inhA蛋白 ,比较其吸收光谱的变化 ;进一步将 0 .3 5mg/ml的inhA分别与 4μmol/L、10 μmol/L、2 0 μmol/L、50 μmol/L和 10 0 μmol/L的NADH室温作用 10min ,同样检测其吸收峰的变化 ,通过米氏方程的推导求出inhA与NADH复合物的解离常数。结果　与NADH作用后inhA吸光峰的幅度显著减小 ,出现了新吸光峰 ;经米氏方程的推导求得的解离常数为 14 .6× 10 -6mol。结论　结核杆菌H3 7RvinhA与NADH具很强的结合力。

关键词：结核病异烟肼结核杆菌 enoyl-酰基载体蛋白还原酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸