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miR-451a和miR-21-5p双重实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用

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生物化学与生物物理进展 2024年第3期51卷 706-715页

作者：胡舒啸陈惠香胡胜赵一霞季安全李洋廉洁孙启凡中国人民公安大学侦查学院北京100038 公安部鉴定中心现场物证溯源技术国家工程实验室法医遗传学公安部重点实验室北京100038 山西医科大学法医学院太原030001

目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于... 详细信息

目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。

关键词：法医遗传学体液鉴别双重实时荧光定量PCR microRNA

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物体表面灰尘采集及DNA提取方法优化研究

生物化学与生物物理进展 2024年

作者：杨琪彭加金王乐卢颀梅宏成戈文东张涛季安全叶健康克莱中国人民公安大学公安部鉴定中心法医遗传学公安部重点实验室昆明医科大学法医学院福建省公安厅刑事技术总队新疆生产建设兵团公安局

目的灰尘作为法庭科学极具特色和应用价值的物证，其中包含丰富的环境DNA信息，逐渐成为领域内的前沿研究热点。然而，作为办案应用中的关键基础环节，从法庭科学领域实际应用出发的物体表面灰尘的采集及DNA提取研究，仍亟待开展。方法... 详细信息

目的灰尘作为法庭科学极具特色和应用价值的物证，其中包含丰富的环境DNA信息，逐渐成为领域内的前沿研究热点。然而，作为办案应用中的关键基础环节，从法庭科学领域实际应用出发的物体表面灰尘的采集及DNA提取研究，仍亟待开展。方法使用Copan Liquid Amies Elution Swab拭子擦拭物体表面采集灰尘，将采集样品管内拭子头、沉淀、上清液分别提取DNA，评估DNA含量从而选定应处理和裂解的样品管内成分。按照5种不同采样面积(25～400 cm2)采集灰尘样本并检测DNA浓度，确定合适的采样面积。比较3种商业化DNA提取试剂盒对灰尘样本的提取效果，并检测评估提取的灰尘DNA片段大小、提取的灰尘DNA是否含人源DNA，同时通过16S rDNA扩增子测序分析物体表面灰尘DNA中的细菌信息，从而建立灰尘DNA提取产物的质量控制方法。针对DNA提取中的细胞裂解关键步骤，比较评估在不同的细胞裂解方式以及震荡裂解次数下提取DNA的量，从而建立适合灰尘DNA提取的细胞裂解方法。结果灰尘采样管内沉淀与拭子头为DNA的主要来源部位，后续提取时均应纳入处理。灰尘的采样面积与灰尘DNA浓度呈正相关，且灰尘采样面积宜大于5 cm×5 cm。使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒可以获得较高的DNA产量，同时3种DNA提取试剂盒提取的DNA片段大小均无显著差异，从上述灰尘样本提取的DNA中未检出人源DNA，而物体表面灰尘DNA中含有细菌DNA，并且不同采样点之间的微生物物种组成存在差异。此外，使用生物样品均质器进行研磨裂解4 min（2 min×2次）时，得到的灰尘DNA浓度最高。结论灰尘DNA的提取与采样面积、提取试剂盒、裂解方式均有关，建立完整且适合的灰尘DNA提取方案至关重要。这不仅为研究挖掘灰尘中的环境DNA数据打下基础，还为环境样本的实际办案应用提供了方法参考。

关键词：灰尘DNA 灰尘采集 DNA提取微生物组

SHERLOCK-HBA检测方法的建立及其在血液鉴别中的应用

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生物化学与生物物理进展 2024年第8期51卷 1971-1982页

作者：姚乾威何红霞胡胜赵一霞罗雨季安全孙启凡山西医科大学法医学院太原030001 公安部鉴定中心法医遗传学公安部重点实验室北京100038 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所北京100071

目的基于规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR关联蛋白质系统(Cas)技术建立检测血液特异性血红蛋白α(HBA)mRNA的方法,以准确、快速地鉴定血液样本。方法本研究通过设计和筛选血液特异性HBA mRNA上的CRISPR RNA(crRNA)短片段,基于C... 详细信息

目的基于规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR关联蛋白质系统(Cas)技术建立检测血液特异性血红蛋白α(HBA)mRNA的方法,以准确、快速地鉴定血液样本。方法本研究通过设计和筛选血液特异性HBA mRNA上的CRISPR RNA(crRNA)短片段,基于CRISPR/Cas技术原理建立了SHERLOCK-HBA检测方法,对5种体液(包括外周血、月经血、唾液、阴道分泌液、精液)共79份样本进行检测以评价所建方法鉴别血液的能力,并通过种属特异性实验、灵敏度实验、模拟混合斑检测、模拟降解样本检测、实际案件样本检测等进一步验证实验体系的法医学应用能力。结果该方法检测人源血液的相对荧光单位(RFU)值显著高于非血液(P<0.0001)以及非人源血液样本(P<0.0001),对血液RNA的检出灵敏度可达1×10^(-3) ng,且可成功检测出混合斑迹以及陈旧降解斑迹中的微量血液成分。结论本研究成功建立了一种基于CRISPR/Cas技术的SHERLOCK-HBA检测体系,能准确、灵敏地鉴定血液,操作简单、快速,为快速识别血液类样本提供了新的思路和参考。

关键词：法医遗传学血液鉴定血红蛋白α CRISPR/Cas SHERLOCK

一种基于DNA甲基化的法医体液组织来源鉴定复合扩增体系有效性验证

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刑事技术 2024年

作者：李琛扬丁冬升邹广发王科文丰蕾郭向前季安全河南大学基础医学院公安部鉴定中心法医遗传学公安部重点实验室大庆市公安局刑事技术支队

本文对文献报道的由9个CpG位点构成的复合扩增体系进行有效性验证，探究该体系在中国人群中的适用性。选取唾液、精液、血液、阴道分泌液、月经血五种体液共236个样本，使用SNaPshot复合扩增体系检测9个CpG位点的甲基化值，位点判定阈... 详细信息

本文对文献报道的由9个CpG位点构成的复合扩增体系进行有效性验证，探究该体系在中国人群中的适用性。选取唾液、精液、血液、阴道分泌液、月经血五种体液共236个样本，使用SNaPshot复合扩增体系检测9个CpG位点的甲基化值，位点判定阈值设为甲基化值大于0.1。使用重亚硫酸氢盐转化后DNA（模板量范围为10～0.5 ng）对该体系进行分析。选取唾液、精液、血液、阴道分泌液四种体液DNA，两两分别按照1∶1,1∶5,1∶10,1∶20的比例混合后进行检测。最后，利用五种体液共计232份样本实验数据集进行模型的构建与测试，其中训练集（n=162）用于构建随机森林模型，测试集（n=70）对体液类型进行预测，检验模型预测效果，同时添加外部数据集（n=40）作为验证集对模型的预测效果进行验证。直接根据特异性峰检出判定，唾液、精液、血液、阴道分泌液和月经血样本鉴定准确率分别为100%、98%、98%、94%和21%。该体系对10～1 ng的重亚硫酸氢盐转化后DNA均可有效检测。在混合样本中，1∶1比例混合的样本均可被正确鉴别；1∶5、1∶10和1∶20混合样本均能检出主要成分，次要成分检出存在较大差异。利用232份样本构建随机森林模型，测试集与验证集中的五种体液来源鉴定准确性均为100%。综上，该复合扩增体系具有良好的法医学应用价值。

关键词： DNA甲基化复合扩增体系 SNaPshot 体液组织来源鉴定

二代测序Y-STR序列多态性之“折叠序列”变异助力侦破21年冷案

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刑事技术 2024年

作者：张驰康克莱李蓓孙博雅缪磊焦瑞莲孟洋赵杰贺琳季安全王乐邢台市公安局公安部鉴定中心法医遗传学公安部重点实验室

基于传统毛细管电泳技术的STR检验仅关注长度多态性，不能报告STR等长等位基因间的SNP、InDel等序列差异信息。二代测序技术可以检出更丰富的STR序列多态性，既包括重复区的重复序列和非重复间隔序列信息，也包括侧翼区的序列信息，支... 详细信息

基于传统毛细管电泳技术的STR检验仅关注长度多态性，不能报告STR等长等位基因间的SNP、InDel等序列差异信息。二代测序技术可以检出更丰富的STR序列多态性，既包括重复区的重复序列和非重复间隔序列信息，也包括侧翼区的序列信息，支撑更精准的比对分析。本文报道一起长达21年未破的入室杀人案，用传统Y-STR检测方法得到了38个Y-STR基因座长度多态性分型。通过二代测序方法，使用STRSeqTyperY68试剂盒检验1份现场物证和8份比对样本，均得到了全部67个Y-STR基因座序列多态性分型，其中DYS448基因座N42“折叠序列”中的一个单碱基变异为案件指明方向，提供了关键的技术支撑。本文进一步探讨了DYS448基因座N42“折叠序列”在不同人群中的序列变异情况，以及STRSeqTyperY68试剂盒中具有“折叠序列”的基因座详细信息，为相关研究和案件应用提供参考。

关键词：法医遗传学二代测序 Y-STR 序列多态性冷案

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环境DNA检验及地域来源推断研究进展

中国法医学杂志 2024年第3期39卷 349-356页

作者：杨琪康克莱梅宏成彭加金袁嘉辉冯耀森叶健季安全王乐法医遗传学公安部重点实验室公安部鉴定中心北京100038 中国人民公安大学北京100038 昆明医科大学法医学院云南昆明650500

法庭科学物证的地域来源为侦查破案提供重要信息,是案件的关键要素之一。已有研究表明不同地域的微生物分布具有显著差异,检测环境样本中的DNA进而推断物证的地理空间来源可为案件办理提供线索和证据。然而,由于犯罪环境的多样性以及刑... 详细信息

法庭科学物证的地域来源为侦查破案提供重要信息,是案件的关键要素之一。已有研究表明不同地域的微生物分布具有显著差异,检测环境样本中的DNA进而推断物证的地理空间来源可为案件办理提供线索和证据。然而,由于犯罪环境的多样性以及刑事案件中检材量往往甚微,在法庭科学领域尚不具有稳定可靠的技术方法。本文总结了灰尘、土壤、水、空气四种环境样本的采集、DNA提取方法,比较了扩增子测序和宏基因组测序在环境生物群体研究中的差异,概述了基于高通量测序的数据分析全流程方法,并重点回顾综述了基于细菌、真菌、其他真核生物推断环境生物信息地理来源的研究现状,为在法医DNA实验室建立环境DNA的检验分析方法以及挖掘环境DNA信息服务法庭科学应用提供参考。

关键词：法医物证学环境DNA 微生物组高通量测序地域来源推断

东亚人群毛干蛋白中单氨基酸多态性检测方法建立与个体识别应用

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生物化学与生物物理进展 2022年第9期49卷 1774-1784页

作者：吴佳蕾季安全丁冬升丰蕾叶健中国人民公安大学研究生院北京100038 公安部物证鉴定中心现场物证溯源技术国家工程实验室法医遗传学公安部重点实验室北京100038

目的毛干是案件现场常见的生物物证,目前缺少有效的个体识别方法而未能在案件调查和法庭诉讼中发挥作用。毛干蛋白质组中的单氨基酸多态性(SAP)蕴含着个体遗传差异信息,可应用于个体识别。方法为研究毛干物证SAP个体差异,本文使用离子... 详细信息

目的毛干是案件现场常见的生物物证,目前缺少有效的个体识别方法而未能在案件调查和法庭诉讼中发挥作用。毛干蛋白质组中的单氨基酸多态性(SAP)蕴含着个体遗传差异信息,可应用于个体识别。方法为研究毛干物证SAP个体差异,本文使用离子液体对12份2 cm长的毛干样本(6人,每人2根)经过前处理后,进行LC-MS/MS质谱检测,分析毛干中的蛋白质组成。然后利用自建的东亚人群SAP蛋白质序列数据库,对质谱数据进行搜库分析,依据自建的SAP与SNP对应注释表信息,推导出SAP对应的nsSNP分型,并且与外显子测序nsSNP结果比较,进而验证SAP检测的准确性。最后,利用验证准确的SAP分型进行随机匹配概率的计算。结果12份样品共计获得321个SAP,每个样本平均为(131±17)个。6人的随机匹配概率数值范围为1.4×10^(-4)~1.0×10^(-9)。结论本文建立了东亚人群毛干蛋白中SAP检测方法,并验证了个体识别应用的能力,为法庭科学中毛干个体识别提供了有力的工具和新的思路。

关键词：毛干蛋白质组单氨基酸多态性个体识别

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毛干蛋白单氨基酸多态性鉴定研究

刑事技术 2023年第2期48卷 128-137页

作者：桂虚吴佳蕾季安全丰蕾叶健中国人民公安大学北京100038 公安部鉴定中心现场物证溯源技术国家工程实验室法医遗传学公安部重点实验室北京100038

本文建立了毛干蛋白单氨基酸多态性(single amino acid polymorphism,SAP)的质谱检测方法,以DNA测序验证方法的准确性,并设计多组样本检验SAP鉴定的重现性。对来自6个人的25份毛干样本的SAP鉴定结果进行分析,并与毛干来源人的血液外显... 详细信息

本文建立了毛干蛋白单氨基酸多态性(single amino acid polymorphism,SAP)的质谱检测方法,以DNA测序验证方法的准确性,并设计多组样本检验SAP鉴定的重现性。对来自6个人的25份毛干样本的SAP鉴定结果进行分析,并与毛干来源人的血液外显子测序结果相比较,对于不一致位点进一步使用Sanger法测序确定SAP对应的SNP分型。共设计四组重复性实验测试,对不同直径/生长部位毛干的分型结果进行了一致性验证。通过设计的376对引物进行PCR扩增,成功检测了522个SNP分型,其中32个(6.1%)与前期外显子测序分型不一致,152个(29.1%)为外显子测序中未检测的分型,338个(64.8%)与外显子分型结果一致。四组重复性实验中,组内SAP鉴定准确率平均值为93.6%(95%CI:92.8%~94.5%),鉴定重现率平均值为96.0%(95%CI:94.3%~97.6%)。在所有25份样本中,有283个SAP位点在至少两个样本中检出,其中23个位点在全部样本中都被检出。因此,毛干蛋白SAP鉴定方法具有较高的准确性和重现性,得到的23个高检出率SAP位点可作为候选位点构建有效位点组合,呈现出潜在的法医学应用价值。

关键词：法医遗传学毛干蛋白质组单氨基酸多态性非同义单核苷酸多态性 DNA测序

miR-451a和miR-21-5p双重qPCR检测体系的建立及应用

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生物化学与生物物理进展 2023年

作者：胡舒啸陈惠香胡胜赵一霞季安全李洋廉洁孙启凡山西医科大学公安部鉴定中心现场物证溯源技术国家工程实验室法医遗传学公安部重点实验室中国人民公安大学侦查学院

目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率，本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR（quantitativereal-timePCR，qPCR）检测体系，并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于mi... 详细信息

目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率，本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR（quantitativereal-timePCR，qPCR）检测体系，并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分，建立基于TaqMan技术的miRNA双重qPCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性；使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测，并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力；使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重qPCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半，为后续建立更多重的qPCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。

关键词：法医遗传学体液鉴别双重qPCR 微RNA