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山羊乳腺特异性载体的构建及细胞转染

山羊乳腺特异性载体的构建及细胞转染

作者：孙达权西北农林科技大学

学位级别：硕士

基因打靶通过DNA转移手段将外源DNA导入靶细胞或组织中,利用外源DNA序列与靶细胞内基因组中部分DNA序列间的同源性使它们在分裂前期发生DNA间的同源重组,从而对靶细胞基因组上的某一确定位点或座位进行精确的遗传修饰的一门新技术。乳... 详细信息

基因打靶通过DNA转移手段将外源DNA导入靶细胞或组织中,利用外源DNA序列与靶细胞内基因组中部分DNA序列间的同源性使它们在分裂前期发生DNA间的同源重组,从而对靶细胞基因组上的某一确定位点或座位进行精确的遗传修饰的一门新技术。乳腺生物反应器是基于胚胎操作和转基因技术平台,外源基因导入动物基因组中并利用内源基因的启动元件使外源基因在动物乳腺中表达,并利用动物乳腺的分泌能力从乳汁中获得具有重要使用价值的药用蛋白等外源蛋白的一类转基因动物的总称。随机整合将外源基因随机导入靶细胞基因组中,由于“位置效应”而导致外源基因表达低下甚至沉默。为提高外源蛋白在转基因动物中的表达量,本研究以基因打靶等技术构建山羊乳腺特异性载体,并通过稳定转染和细胞筛选来获得中靶转基因山羊胎儿成纤维细胞,以中靶体细胞为核供体细胞生产乳腺生物反应器动物,解决了外源基因由于随机整合而产生“位置效应”这一难题,并利用乳蛋白基因的启动元件在乳腺中高效表达外源基因。本试验以山羊β-酪蛋白基因座为打靶位点,从西农萨能奶山羊血液中提取DNA基因组,利用LA-PCR分两段扩增了山羊的β-酪蛋白基因,经TA克隆和鉴定后再用LA-PCR的方法从中克隆了该基因的5’端包括调控序列和信号肽在内的3 kb的DNA序列和3’端2 kb的DNA序列作为两条同源臂。同时以在两个LoxP之间插有新霉素磷酸转移酶基因(neo)并在两个LoxP外侧各有一个疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的通用性打靶载体pA2T为骨架载体,构建了乳腺特异性条件性基因打靶载体。采用具有广谱抗菌、抗病毒、改善免疫、组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等作用的人溶菌酶基因和具有溶解血块、保持血管的畅通等作用且半衰期相对较长的指形区缺乏的人组织纤溶酶原激活剂基因为打靶载体的外源目的基因,两者均通过PCR从带有该基因的载体中克隆出来的,并通过酶切和连接的方法构建打靶载体。另外,试验以带有核定位信号的AcGFP基因为标记基因,外源目的基因通过具有独立起始翻译随后基因作用的IRES序列与AcGFP基因相联系。以质粒pEGFP-C1为骨架载体,先通过改造GFP基因ATG附近的序列使GFP高效表达,再将具有增强剪接作用的间插序列(IVS)与IRES序列与GFP基因相连,再在IVS前加入另一个带有多克隆位点的IVS,构建了载体p3I-GFP,通过细胞转染确实发现载体p3I-GFP及去除了MluI位点的p3I-GFPN能够高效表达标记基因,且荧光亮度要明显高于购买的pIRES2-AcGFP-Nuc载体。再以p3I-GFPN为骨架载体,将人溶菌酶基因导入多克隆位点,通过细胞转染发现的确能够表达绿色荧光蛋白。在此基础上,在CMV启动子和人溶菌酶基因之间插入山羊CSN2的启动子,再将GFP基因用从人胎盘中以PCR的方法扩增获得的干扰素A基因替代,最终构建了一个乳腺中独立表达人溶菌酶和人干扰素蛋白的载体,用于乳腺炎防治的研究。为获得中靶山羊胎儿成纤维细胞株,本试验以山羊胎儿成纤维细胞为打靶体细胞,脂质体2000转染细胞后用含800μg/ml的遗传霉素初步筛选培养,7天后用含400μg/ml的遗传霉素和200 nmol/ml的丙氧鸟苷的细胞筛选液筛选培养,初步筛选中靶细胞。为获得纯化的中靶细胞株,首先建立一个单细胞培养体系,即以5 mg/ml丝裂霉素C处理2h的山羊胎儿成纤维细胞为饲养层和新鲜的细胞培养液,以这个单细胞培养体系培养初步筛选的中靶单个细胞,最后得到扩增的细胞株,再用含400μg/ml的遗传霉素和100 nmol/ml的丙氧鸟苷的细胞培养液培养,获得纯化的中靶山羊胎儿成纤维细胞株。

关键词：山羊基因打靶人溶菌酶人干扰素A 指形区缺乏的人组织纤溶酶原激活剂

C／EBPβ mRNA3′非翻译区肿瘤抑制功能的分子机制--同时缺失3段短序列降低其肿瘤抑制活性

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生物化学与生物物理进展 2009年第9期36卷 1134-1140页

作者：王海震王莹孙达权刘定干中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031

CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)mRNA的3′非翻译区(3′UTR),是先前工作发现的一个具有肿瘤抑制功能的RNA调控元件.应用基因定点突变技术将该3′UTRcDNA上的三段核苷酸同时缺失掉,将缺失突变体稳定转染人肝癌细胞系SMMC-7721,并检测了... 详细信息

CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)mRNA的3′非翻译区(3′UTR),是先前工作发现的一个具有肿瘤抑制功能的RNA调控元件.应用基因定点突变技术将该3′UTRcDNA上的三段核苷酸同时缺失掉,将缺失突变体稳定转染人肝癌细胞系SMMC-7721,并检测了该缺失突变体对SMMC-7721细胞系表型的影响,包括测定稳转细胞系的生长曲线、软琼脂集落形成能力、细胞集落形成能力及裸小鼠成瘤性.研究发现,C/EBPβ3′UTR中这三段短序列的同时缺失明显降低了3′UTR的肿瘤抑制活性,使受其稳定转染的细胞系恶性显著增强.人全基因组基因芯片分析和实时荧光RT-PCR分析结果表明,与回复对照细胞相比,缺失突变3′UTR稳定转染细胞中,一些癌基因的表达量有所增加,而一些抑癌基因的表达量有所下降,这提示上述三段短序列是C/EBPβ3′UTR的肿瘤抑制功能所同时需要的.

关键词： C/EBPβ 3′非翻译区抑癌作用分子机制

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人-牛异种克隆胚构建及其线粒体来源

生物工程学报 2008年第7期24卷 1210-1215页

作者：杨鹭张东王勇胜孙达权张涌西北农林科技大学动物医学学院生物工程研究所杨凌712100

通过人-牛异种核移植技术获得异种克隆囊胚,便于在不消耗人类卵母细胞的情况下从异种克隆胚中分离出人类干细胞。通过透明带下注射法将人胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞分别注入去核牛卵母细胞中构建异种和同种胚胎,并比较两者之间... 详细信息

通过人-牛异种核移植技术获得异种克隆囊胚,便于在不消耗人类卵母细胞的情况下从异种克隆胚中分离出人类干细胞。通过透明带下注射法将人胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞分别注入去核牛卵母细胞中构建异种和同种胚胎,并比较两者之间的融合率、卵裂率、8-细胞发育率以及囊胚率。并对处于2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚、囊胚阶段的异种克隆胚的线粒体DNA来源进行检测。结果表明,异种克隆胚体外各个阶段的发育率均低于同种克隆胚,尤其是8-细胞到囊胚阶段的发育率,以及囊胚率都显著低于同种克隆胚(P<0.05)。异种克隆胚在2-细胞到桑椹胚阶段检测到人、牛线粒体DNA共存,囊胚阶段只检测到牛线粒体DNA。结果表明:牛卵母细胞可以重编程人胎儿成纤维细胞,完成异种克隆胚植入前的胚胎发育,异种克隆胚由于核质相互作用的不谐调,影响其发育能力,使其囊胚率显著低于同种克隆胚。牛线粒体DNA存在于植入前异种胚胎发育的各个阶段。异种克隆胚胎用于人类胚胎干细胞分离具有可行性。

关键词：异种克隆治疗性克隆体细胞核移植线粒体

提高易自聚合蛋白质与核酸相互作用效率的一种简单方法

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生物化学与生物物理进展 2011年第2期38卷 173-176页

作者：王莹孙达权刘定干中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031

对蛋白质、DNA和RNA的相互作用(结合)的研究是分子生物学的基本课题.多数DNA和RNA的结合蛋白都具有自聚合倾向,在体外实验中会造成难以和DNA或RNA形成结合物而影响实验的结果.用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记蛋白质能显著抑制这种自聚合倾... 详细信息

对蛋白质、DNA和RNA的相互作用(结合)的研究是分子生物学的基本课题.多数DNA和RNA的结合蛋白都具有自聚合倾向,在体外实验中会造成难以和DNA或RNA形成结合物而影响实验的结果.用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记蛋白质能显著抑制这种自聚合倾向,而大幅度提高其与核酸分子的结合效率.这一简单方法已用于在细胞角蛋白18与转录因子C/EBPβ3′UTR RNA结合研究中.

关键词：抑制自聚合核酸蛋白相互作用荧光素异硫氰酸酯(FITC)

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水通道蛋白与植物的抗旱性

干旱地区农业研究 2005年第6期23卷 214-218页

作者：杨淑慎山仑郭蔼光高梅孙达权邵艳军西北农林科技大学陕西杨凌712100

水通道蛋白(aquaporin,AQP)构成水分运输的特异性通道,促进水的长距离运输,调节细胞内外水分平衡,并运输其它小分子物质。有专一性、高效性、可调控性和活性差异性等特点。本文就近几年来AQP的结构、功能、调节机理及其与植物抗旱性研... 详细信息

水通道蛋白(aquaporin,AQP)构成水分运输的特异性通道,促进水的长距离运输,调节细胞内外水分平衡,并运输其它小分子物质。有专一性、高效性、可调控性和活性差异性等特点。本文就近几年来AQP的结构、功能、调节机理及其与植物抗旱性研究进展作一简要综述。

关键词：水通道蛋白水分运输植物抗旱性

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通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定

生物工程学报 2008年第10期24卷 1818-1823页

作者：陈兴启孙达权刘凤军贾淑玲张涌西北农林科技大学动物医学院生物工程研究所杨凌712100

为了构建适合大多数基因座位点打靶的通用型基因打靶载体及打靶成功后去除正选择标记基因,以克隆载体pGEM-3Z为骨架,插入了一个正选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因(neo)、两个相同的负选择标记基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk1和HS... 详细信息

为了构建适合大多数基因座位点打靶的通用型基因打靶载体及打靶成功后去除正选择标记基因,以克隆载体pGEM-3Z为骨架,插入了一个正选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因(neo)、两个相同的负选择标记基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk1和HSV-tk2,并在neo的两侧各添加了一个方向相同的LoxP(locus of crossing-over(x)in P1)序列及两个不同的多克隆位点序列,从而构建了载体pA2T。插入的两个不同的多克隆位点序列中,neo和HSV-tk1之间的多克隆位点序列有8个稀少的酶切位点、neo和HSV-tk2之间的多克隆位点序列有5个稀少的酶切位点,neo、HSV-tk1和HSV-tk2有各自独立的转录单元。脂质体法转染山羊成纤维细胞,用遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GAC)进行正负筛选,验证了正负选择标记基因的生物活性,证明通用型基因打靶载体pA2T构建成功。载体pA2T转化组成性表达Cre重组酶(Cyclization recombination protein)的大肠杆菌BM25.8,检测到LoxP序列的生物活性,结果表明pA2T中的正选基因可以被Cre重组酶去除。因此,本研究所构建的通用型基因打靶载体pA2T,根据不同的基因座设计同源臂后,插入到MCS中可直接用于不同基因座位点的打靶,并能够在打靶成功后用Cre重组酶去除基因组中插入的neo基因,为用基因打靶的方法制作转基因动物提供了便利。

关键词：转基因动物通用型基因打靶载体 LoxP序列 Cre重组酶

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渡僧桥与吊桥

苏州杂志 2004年第4期 74-75页

作者：孙达权

苏州红栏三百九十桥,为人民提供了交通的方便,又为古城增添了秀色,更是历史沧桑的见证人和传奇民间故事的载体。在苏州众多的历史名桥中,渡僧桥和吊桥就是其中之一。渡僧桥横跨古运河,在很久以前,这一带还是芦苇丛生的一汪碧水,岸边袅... 详细信息

苏州红栏三百九十桥,为人民提供了交通的方便,又为古城增添了秀色,更是历史沧桑的见证人和传奇民间故事的载体。在苏州众多的历史名桥中,渡僧桥和吊桥就是其中之一。渡僧桥横跨古运河,在很久以前,这一带还是芦苇丛生的一汪碧水,岸边袅袅垂柳,一片田园风光。

关键词：古运河吊桥苏州民间故事田园风光古桥见证人太平天国交通重建

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渡僧桥与吊桥

江苏交通 2000年第8期 52-53页

作者：孙达权

亚砷酸钠对神经细胞活力及3MST蛋白表达的影响

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现代预防医学 2017年第11期44卷 2046-2049页

作者：王念潘际刚范海琼聂杨孙达权徐国强贵州医科大学生理学教研室

目的探讨亚砷酸钠（NaAsO;）对PC12细胞的生长和3-巯基丙酮酸硫基转移酶（3MST）表达的影响。方法PC12细胞分别暴露于20、40、60、80、100μmol·L;NaAsO;12、24、36和48小时。倒置显微镜观察PC12细胞在药物处理后的形态变化。MTT法测定... 详细信息

目的探讨亚砷酸钠（NaAsO;）对PC12细胞的生长和3-巯基丙酮酸硫基转移酶（3MST）表达的影响。方法PC12细胞分别暴露于20、40、60、80、100μmol·L;NaAsO;12、24、36和48小时。倒置显微镜观察PC12细胞在药物处理后的形态变化。MTT法测定NaAsO;在不同时间、不同浓度对PC12细胞存活率的影响;Western blot检测PC12细胞3MST的表达。结果亚砷酸钠引起细胞缩小、胞体变圆、细胞间隙变宽和死细胞增多等显著细胞形态学改变。40-100μmol·L;亚砷酸钠可以明显降低PC12细胞的存活率;3MST蛋白表达也显著减少,呈现剂量和时间依赖效应（P<0.05）。结论亚砷酸钠可抑制PC12细胞生长、诱导细胞损伤,其作用机制可能与下调3MST的表达有关。

关键词：亚砷酸钠 3-巯基丙酮酸硫基转移酶 PC12细胞