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脑膜瘤组织中MGMT甲基化状态及其对脑膜瘤细胞生长与转移的影响

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中国医师杂志 2022年第3期24卷 377-382页

作者：胡德献孙衍昶冯基高莫业和海南医学院第二附属医院神经外科海口570311

目的探讨O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)在脑膜瘤组织中的甲基化状态及其对人脑膜瘤细胞系IOMM-Lee细胞生长和转移的作用。方法收集本院34例脑膜瘤患者的标本,甲基化特异的PCR(MSP)法检测脑膜瘤组织和正常脑组织中MGMT甲基化水平,... 详细信息

目的探讨O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)在脑膜瘤组织中的甲基化状态及其对人脑膜瘤细胞系IOMM-Lee细胞生长和转移的作用。方法收集本院34例脑膜瘤患者的标本,甲基化特异的PCR(MSP)法检测脑膜瘤组织和正常脑组织中MGMT甲基化水平,免疫组织化学染色检测脑膜瘤组织和正常脑组织中MGMT表达。将培养的人胶质瘤细胞系IOMM-Lee细胞分为空白对照组(正常培养的IOMM-Lee细胞)、阴性对照组(空载体病毒转染IOMM-Lee细胞)和RNAi慢病毒转染组(转染RNAi慢病毒载体下调MGMT表达的IOMM-Lee细胞),通过RNAi技术沉默IOMM-Lee细胞中MGMT的表达,实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞中MGMT mRNA与蛋白表达水平,CCK-8实验检测细胞增殖活性,细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,Transwell实验和细胞划痕实验分别检测各组细胞侵袭与迁移能力。结果脑膜瘤组织中MGMT甲基化达到88.23%(30/34),正常脑组织中未检测到MGMT甲基化;脑膜瘤组织中MGMT染色强度较正常脑组织明显增加。与空白对照组和阴性对照组比较,RNAi慢病毒转染组IOMM-Lee细胞中MGMT mRNA和蛋白相对表达量均显著下降(均P<0.05),转染24、48和72 h后IOMM-Lee细胞增殖活性显著下降(均P<0.05),细胞克隆形成数目、细胞侵袭数目显著下降(均P<0.05),同时,细胞划痕愈合率显著降低(P<0.05)。结论MGMT在人脑膜瘤组织中多呈高甲基化,沉默脑膜瘤细胞中MGMT表达可抑制脑膜瘤细胞生长与转移。

关键词：脑膜瘤 O(6)-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶甲基化细胞增殖细胞迁移

BDNF/TrKB介导的突触丢失对创伤性脑损伤小鼠远期认知障碍的影响及机制

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中国老年学杂志 2023年第24期43卷 5978-5984页

作者：孙衍昶冯基高欧阳一彬刘达远海南医学院附属第二医院神经外科海南海口570311

目的探究脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体(TrK)B介导的突触丢失对创伤性脑损伤(TBI)小鼠远期认知障碍的影响及机制。方法采用改良的Allen重锤打击法制作TBI模型,将小鼠分为Sham组、TBI组、TBI_OE_NC组、TBI_OE_BDNF组、TBI_Sh... 详细信息

目的探究脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体(TrK)B介导的突触丢失对创伤性脑损伤(TBI)小鼠远期认知障碍的影响及机制。方法采用改良的Allen重锤打击法制作TBI模型,将小鼠分为Sham组、TBI组、TBI_OE_NC组、TBI_OE_BDNF组、TBI_Sh_NC组、TBI_Sh_BDNF组,每组40只。Sham组、TBI组分别在造模后1、3、5、7 d检测神经元突触后致密物厚度和突触体密度、BDNF、TrkB mRNA及蛋白表达。将OE_NC和OE_BDNF组腺病毒载体3μl注入承受单侧大脑皮质重锤打击的小鼠海马体,免疫荧光法检测BDNF、突触素(Synaptophysin)在小鼠海马体中的表达,Western印迹检测TrkB、p-TrkB、突触蛋白(SYN)1、SYNA、突触后致密蛋白(PSD)95等蛋白表达水平,Morris水迷宫实验检测小鼠定位航行和空间探索能力。将TBI_Sh_NC和TBI_Sh_BDNF组腺病毒载体3μl注入正常小鼠海马体,免疫荧光法检测Synaptophysin在海马体中的表达,Morris水迷宫实验检测定位航行和空间探索能力。TUNEL法检测Sham、OE_NC和OE_BDNF组脑组织细胞凋亡水平,Western印迹检测磷脂酰激酶-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、p-PI3K、p-AKT、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、cleaved-半胱天冬蛋白酶(caspased)3等蛋白水平。结果与Sham组比较,TBI组脑海马体神经元突触后致密物厚度(5、7 d)和突触体密度(3、5、7 d)显著降低(P<0.05)。TBI组BDNF、TrkB mRNA和蛋白水平随时间逐渐降低(P<0.05)。相较于TBI_OE_NC组,TBI_OE_BDNF组脑海马体中BDNF、TrkB、p-TrkB、SYN1、SYNA、PSD95表达提高,细胞凋亡水平降低,p-PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白表达增加,Bax、cleaved-caspased3蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论TBI诱导BDNF-TrkB表达减少,进而抑制PI3K/Akt通路开启细胞凋亡途径,导致突触数量减少,损伤小鼠的远期认知能力。

关键词：创伤性脑损伤突触丢失脑源性神经营养因子(BDNF) 酪氨酸激酶受体(TrkB) 认知障碍

外泌体转运miR-223改善创伤性脑损伤的作用和机制

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安徽医科大学学报 2023年第7期58卷 1111-1118页

作者：孙衍昶徐鹏翔何青龙欧阳一彬莫业和海南医学院第二附属医院神经外科一区海口570311

目的探究外泌体(Exo)转运miR-223对创伤性脑损伤(TBI)大鼠脑组织损伤与小胶质细胞活化的影响及机制。方法通过脂质体法分别将miR-NC质粒、miR-223 mimic质粒转染至HEK293细胞,实时荧光定量PCR测定细胞中miR-223表达水平;提取转染后HEK29... 详细信息

目的探究外泌体(Exo)转运miR-223对创伤性脑损伤(TBI)大鼠脑组织损伤与小胶质细胞活化的影响及机制。方法通过脂质体法分别将miR-NC质粒、miR-223 mimic质粒转染至HEK293细胞,实时荧光定量PCR测定细胞中miR-223表达水平;提取转染后HEK293细胞Exo,通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析及Western blot对Exo进行鉴定,并采用实时荧光定量PCR测定Exo中miR-223表达水平;将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、NC-Exo组、miR-223-Exo组,每组10只。除假手术组外的3组大鼠均通过改良Feeney自由落体法制备TBI模型,NC-Exo组与miR-223-Exo组大鼠分别经尾静脉注射转染miR-NC质粒细胞来源的Exo、转染miR-223 mimic质粒细胞来源的Exo;2周后,苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠脑组织病理学变化,尼氏(Nissl)染色检测各组大鼠尼氏体改变与分布情况,酶联免疫吸附实验(ELISA)测定各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)水平,免疫荧光双染法观察各组大鼠脑组织内Nod样受体蛋白3(NLRP3)与离子钙接头蛋白(Iba-1)表达,Western blot测定各组大鼠脑组织内NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)的蛋白表达水平。结果细胞转染后,与对照组和miR-NC组比较,miR-223组细胞中miR-223相对表达量显著增加(P<0.05);分离的颗粒物具有典型的Exo形态,粒径峰值大约处于120 nm,Exo标志蛋白CD9、CD63及CD81均明显高表达,且miR-223相对表达量显著增加(P<0.05)。与模型组比较,miR-223-Exo组大鼠脑组织损伤现象得到改善,尼氏体形态恢复且数目增加,血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低(P<0.05),脑组织内NLRP3与Iba-1荧光染色强度减少(P<0.05),同时,脑组织内NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相对表达量均下调(P<0.05)。结论Exo转运miR-223能够明显改善TBI大鼠脑组织损伤,抑制小胶质细胞激活,该作用可能与抑制NLRP3炎性小体活化相关。

关键词：创伤性脑损伤 miR-223 外泌体小胶质细胞 NLRP3炎性小体

miR-519d-3p靶向KPNA2对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制

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中国老年学杂志 2020年第16期40卷 3535-3542页

作者：胡德献孙衍昶冯基高莫业和海南医学院第二附属医院神经外科海南海口570311

目的探讨微小RNA(miR)-519d-3p对核转运蛋白α-2(KPNA2)的靶向作用及其对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其可能作用机制。方法体外培养胶质瘤细胞株U251、U87、T98G与正常胶质细胞株SVGp12,采用qRT-PCR与Western印迹法检测细胞中mi... 详细信息

目的探讨微小RNA(miR)-519d-3p对核转运蛋白α-2(KPNA2)的靶向作用及其对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其可能作用机制。方法体外培养胶质瘤细胞株U251、U87、T98G与正常胶质细胞株SVGp12,采用qRT-PCR与Western印迹法检测细胞中miR-519d-3p与KPNA2的mRNA及蛋白表达。脂质体将miR-519d-3p mimics、si-KPNA2及其各自阴性对照转染入胶质瘤U251细胞;共转染分组:miR-519d-3p+pcDNA组(miR-519d-3p mimics与pcDNA共转染胶质瘤U251细胞),miR-519d-3p+pcDNA-KPNA2组(miR-519d-3p mimics与pcDNA-KPNA2共转染胶质瘤U251细胞)。MTT实验与Transwell小室检测各组胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭。运用生物信息学方法预测miR-519d-3p与KPNA2的靶向配对关系,采用双荧光素酶报告实验验证miR-519d-3p与KPNA2的作用关系。Western印迹检测CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表达。结果与正常胶质细胞株SVGp12比较,胶质瘤细胞株U251、U87、T98G中miR-519d-3p的表达水平均显著降低(P<0.05),而KPNA2 mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);miR-519d-3p过表达后胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显减弱,促进p21、p27表达,而抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9、MMP-14表达;抑制KPNA2表达后胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显减弱,促进p21表达,而抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达;miR-519d-3p过表达同时上调KPNA2表达后部分逆转miR-519d-3p过表达对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。结论miR-519d-3p可通过负向调控KPNA2表达而抑制胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭。

关键词：胶质瘤 miR-519d-3p KPNA2 增殖迁移侵袭

MicroRNA-145通过Wnt/β-catenin通路调控神经元氧化应激和凋亡在癫痫中的作用及机制研究

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脑与神经疾病杂志 2022年第12期30卷 727-733页

作者：孙衍昶徐鹏翔欧阳一彬莫业和海南医学院第二附属医院神经外科海口570216

目的探讨微小RNA-145(miR-145)在原代培养海马神经元癫痫模型中的作用及其分子机制。方法培养原代海马神经元细胞,构建无镁生理外液诱导的原代培养海马神经元癫痫模型。将细胞分为对照组、模型组、模拟物对照组(NC mimic组)、miR-145模... 详细信息

目的探讨微小RNA-145(miR-145)在原代培养海马神经元癫痫模型中的作用及其分子机制。方法培养原代海马神经元细胞,构建无镁生理外液诱导的原代培养海马神经元癫痫模型。将细胞分为对照组、模型组、模拟物对照组(NC mimic组)、miR-145模拟物组(miR-145 mimic组)、miR-145模拟物+空载质粒组(miR-145 mimic+Vector组)、miR-145模拟物+WNT2B过表达质粒组(miR-145mimic+pcDNA-WNT2B组)。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验检测各组神经元细胞中miR-145的表达;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;ELISA试剂盒检测各组细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的含量;Western blotting检测各组细胞中Bcl-2、Cleaved-caspase 3、β-catenin和Cyclin D1蛋白的表达。生物信息学软件和双荧光素酶报告基因实验分别预测和验证miR-145和WNT2B的靶向关系。结果与对照组比较,模型组神经元细胞中miR-145表达显著降低,MDA水平显著升高,GSH和SOD水平显著降低,细胞凋亡率显著升高,Bcl-2蛋白水平显著降低,Cleaved caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05)。与NC mimic组比较,miR-145 mimic组神经元细胞中miR-145表达显著升高,MDA水平显著降低,GSH和SOD水平显著升高,细胞凋亡率显著降低,Bcl-2蛋白水平显著升高,Cleaved caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05)。miR-145与WNT2B 3’-UTR靶向结合。与miR-145 mimic+Vector组比较,miR-145 mimic+pcDNA-WNT2B组神经元细胞中WNT2B蛋白表达显著升高,MDA水平显著升高,GSH和SOD水平显著降低,细胞凋亡率显著升高,Bcl-2蛋白水平显著降低,Cleaved caspase-3、β-catenin和Cyclin D1蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论miR-145通过靶向WNT2B调控Wnt/β-catenin通路抑制癫痫模型海马神经元氧化应激和凋亡。

关键词： MicroRNA-145 癫痫 Wnt/β-catenin信号通路氧化应激凋亡

表达LAG-3抗体的溶瘤腺病毒对成胶质细胞瘤的抗瘤性

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中国肿瘤生物治疗杂志 2021年第1期28卷 11-16页

作者：欧阳一彬何青龙孙衍昶莫业和李渭亮海南医学院第二附属医院神经外科一区海南海口570311 海南医学院基础医学与生命科学学院海南海口571199

目的:探讨共表达淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3,LAG-3)抗体(LAG-3 antibody,aLAG)的溶瘤腺病毒对成胶质细胞瘤的抗肿瘤活性。方法:在溶瘤腺病毒Ad3的骨架中插入aLAG序列,获得重组溶瘤腺病毒Ad3-aLAG。应用WB法检测感... 详细信息

目的:探讨共表达淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3,LAG-3)抗体(LAG-3 antibody,aLAG)的溶瘤腺病毒对成胶质细胞瘤的抗肿瘤活性。方法:在溶瘤腺病毒Ad3的骨架中插入aLAG序列,获得重组溶瘤腺病毒Ad3-aLAG。应用WB法检测感染成胶质细胞瘤GL261细胞中aLAG的表达水平,MTT法检测重组溶瘤腺病毒对GL261细胞的杀伤能力,通过小鼠皮下移植瘤模型评估重组溶瘤腺病毒对成胶质细胞瘤的体内肿瘤生长的抑制效果,免疫组化染色法检测肿瘤浸润T细胞,并通过流式细胞术检测肿瘤浸润T细胞分泌细胞因子TNF-α及IFN-γ的水平。结果:成功构建的重组溶瘤腺病毒可以有效表达aLAG(P<0.01),并且可以在体外杀伤GL261细胞(P<0.01)。小鼠皮下移植瘤模型实验结果显示,重组溶瘤腺病毒Ad3-aLAG较Ad3溶瘤腺病毒而言肿瘤抑制能力更强(P<0.01),并且可以有效增强移植瘤组织中CD3+T细胞的浸润(P<0.01)、增强浸润T细胞分泌IFN-γ的能力(P<0.01)。结论:Ad3-aLAG重组溶瘤腺病毒在体内外均显著抑制成胶质细胞瘤细胞的生长,同时增强体内的抗肿瘤免疫反应,有望为成胶质细胞瘤治疗提供一种新的方案。

关键词：溶瘤腺病毒淋巴细胞活化基因3抗体成胶质细胞瘤小鼠移植瘤免疫治疗

外泌体来源的miR-181a促进胶质瘤的血管生成

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中国肿瘤生物治疗杂志 2021年第4期28卷 325-331页

作者：欧阳一彬何青龙孙衍昶莫业和李渭亮海南医学院第二附属医院神经外科一区海南海口570311 海南医学院基础医学与生命科学学院海南海口571199

目的:探讨外泌体来源的miR-181a对胶质瘤血管生成和肿瘤进展的影响。方法:选用2017年8月至2019年12月海南医学院第二附属医院手术切除的83例胶质瘤和13例瘤旁组织标本,以及胶质瘤细胞U87、A172、U251、LN229、U373和小神经胶质细胞HM,用... 详细信息

目的:探讨外泌体来源的miR-181a对胶质瘤血管生成和肿瘤进展的影响。方法:选用2017年8月至2019年12月海南医学院第二附属医院手术切除的83例胶质瘤和13例瘤旁组织标本,以及胶质瘤细胞U87、A172、U251、LN229、U373和小神经胶质细胞HM,用qPCR法检测瘤组织和细胞中miR-181a的表达水平。构建过表达或敲减miR-181a的U373细胞,分离和鉴定外泌体;用小管形成实验、鸡胚绒毛尿囊膜血管实验观察外泌体来源的miR-181a对HUVEC小管和血管生成的影响。构建裸鼠U373细胞移植瘤模型,观察外泌体来源的miR-181a对血管生成及肿瘤生长的影响。结果:miR-181a在胶质瘤肿瘤组织和细胞中的表达水平明显高于瘤旁组织和HM细胞(均P<0.01)。外泌体来源的miR-181a可以明显促进HUVEC小管的形成和鸡胚尿绒毛囊膜的血管生成(均P<0.01)。裸鼠胶质细胞瘤体内实验发现,回输大量外泌体来源miR-181a的小鼠移植瘤进展更快(P<0.05)、肿瘤组织中血管生成数量显著增加(P<0.01)。结论:miR-181a在促进胶质瘤血管生成中发挥重要作用,可能成为胶质瘤诊断及治疗的潜在靶点。

关键词：胶质瘤 U373细胞外泌体 miR-181a 血管生成

星形细胞瘤FLI-1蛋白表达及其与病人预后的关系

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中国临床神经外科杂志 2022年第4期27卷 266-268,273页

作者：孙衍昶刘达远许鹏翔欧阳一彬莫业和海南医学院第二附属医院神经外科海口570100

目的探讨星形细胞瘤Friend白血病整合素1转录因子(FLI-1)表达水平及其与病人预后的关系。方法选取2015年6月~2018年6月手术切除的术后病理检查确诊的星形细胞瘤标本112例和颅脑损伤内减压术获得非肿瘤脑组织59例(对照组),采用免疫组织... 详细信息

目的探讨星形细胞瘤Friend白血病整合素1转录因子(FLI-1)表达水平及其与病人预后的关系。方法选取2015年6月~2018年6月手术切除的术后病理检查确诊的星形细胞瘤标本112例和颅脑损伤内减压术获得非肿瘤脑组织59例(对照组),采用免疫组织化学染色法检测FLI-1表达情况。术后随访3年,记录无进展生存、总生存情况,其中无进展生存为预后良好,肿瘤进展或病人死亡为预后不良。结果112例星形细胞瘤中,预后良好62例,预后不良50例。星形细胞瘤FLI-1表达阳性率[66.96%(75/112)]明显高于对照组[16.95%(10/59);P<0.05]。星形细胞瘤FLI-1表达与IDH1表达呈明显负相关(r=-0.682,P<0.001),与p53表达呈正明显相关(r=0.711,P<0.001)。多因素logistic回归分析显示FLI-1表达阳性是星形细胞瘤预后不良的独立危险因素(OR=3.758;95%CI 1.439~9.814;P=0.009)。生存曲线分析显示,FLI-1表达阴性病人3年累积无进展生存率(75.68%)、3年累积总生存率(81.08%)均明显高于FLI-1表达阳性的病人(分别为45.33%、49.33%;P<0.05)。结论星形细胞瘤FLI-1呈高表达,与病人的不良预后有关。

关键词：星形细胞瘤 Friend白血病整合素1转录因子 FLI-1 预后基因表达危险因素

放射性脑损伤与缺血缺氧性脑损伤细胞差异分子靶标筛选

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中国处方药 2022年第8期20卷 14-18页

作者：徐鹏翔罗孟亚男王康宁莫业和孙衍昶冯昌奋海南医学院第二附属医院神经外科海南医学院第二附属医院放射治疗科海口570311

目的探讨放射性脑损伤(RBI)与缺血缺氧性脑损伤(HIBI)细胞差异分子靶标。方法从GEO数据库中找到相应的数据集后使用GEO2R筛选差异表达基因。并对放射和对照、缺氧缺血及对照之间的通路富集情况做KEGG和GO分析。而后使用PPI分析找出几个... 详细信息

目的探讨放射性脑损伤(RBI)与缺血缺氧性脑损伤(HIBI)细胞差异分子靶标。方法从GEO数据库中找到相应的数据集后使用GEO2R筛选差异表达基因。并对放射和对照、缺氧缺血及对照之间的通路富集情况做KEGG和GO分析。而后使用PPI分析找出几个关键基因及其蛋白靶标。而后以人星型胶质细胞作为研究对象构建RBI及HIBI模型。在损伤刺激后16 h收集各实验组总细胞和上清中漂浮的坏死细胞,通过RT-PCR和蛋白印迹法分析照射前后以及缺血缺氧处理前后关键基因及其蛋白表达水平之间的差异。结果照射与对照星型胶质细胞共筛选出差异基因237个,其中上调基因95个,下调基因142个。KEGG富集分析结果显示,照射后星型胶质细胞与对照细胞有20条显著差异性富集信号通路(P<0.05)。GO功能分析照射后星型胶质细胞与对照细胞差异显著富集条目62个,其中20个(30.8%)与生物过程(BP)相关,22个(35.4%)与细胞组分(CC)相关,20个(30.8%)与分子功能(MF)相关。缺血缺氧处理与对照星型胶质细胞共筛选出差异基因67个,其中上调基因38个,下调基因29个。KEGG通路富集分析结果显示,缺血缺氧处理后星型胶质细胞与对照细胞有22条显著差异性富集信号通路(P<0.05)。通过差异表达基因的GO功能分析得到显著富集条目35个,其中15个(42.8%)与BP相关,10个(28.6%)与CC相关,10个(28.6%)与分子功能MF相关。STRING分析发现照射后差异表达基因的关键节点基因为EGFR,缺血缺氧处理后差异表达基因的关键节点基因为PHD3。照射组EGFR基因mRNA及蛋白表达水平均显著高于其他两组(P<0.05),缺氧组PHD3基因mRNA及蛋白表达水平均显著高于其他两组(P<0.05)。结论EGFR、PHD3在放射及缺氧缺血处理后的星型胶质细胞中表达有显著差异。

关键词：放射性脑损伤缺氧性脑损伤脑梗死分子靶标