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作者：孔晨帆北京中医药大学

学位级别：硕士

目的:酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）是由于长期过量摄入酒精所导致的一种病程漫长、且发病机制复杂的肝病。在我国,ALD发病率与死亡率正以惊人的速度上升,已成为我国最主要的慢性肝病之一。ALD发病机制未被完全阐明,但肝... 详细信息

目的:酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）是由于长期过量摄入酒精所导致的一种病程漫长、且发病机制复杂的肝病。在我国,ALD发病率与死亡率正以惊人的速度上升,已成为我国最主要的慢性肝病之一。ALD发病机制未被完全阐明,但肝细胞、肝星状细胞等多种细胞已被证实参与其中,肝细胞的凋亡坏死、肝星状细胞的激活转分化贯穿ALD全程。已有大量研究发现肝内的细胞通讯与多种肝病进展关系密切,其中外泌体通过miRNA传递信息在ADL、肝纤维化等疾病中扮演了重要角色。外泌体是一种直径为30-150nm的胞外囊泡,可搭载包括微小RNA（miRNA）在内的多种小分子物质,充当细胞间信息传递的媒介,发挥重要的生物学功能。已有研究证实,肝细胞、肝星状细胞外泌体可以转运至肝内临近细胞,加重肝损伤。前期研究中发现,ALD模型中活化的肝星状细胞来源外泌体可诱导肝细胞凋亡,中药调肝理脾方对ALD具有显著的保护作用,但肝星状细胞来源外泌体诱导肝细胞凋亡以及调肝理脾方保护ALD的具体机制尚不明确。本研究旨在探讨ALD中肝星状细胞外泌体转运的miRNA对肝细胞的作用机制,从肝内细胞通讯的角度探究ALD发生发展中与调肝理脾方治疗ALD的分子机制。方法:（1）ALD中肝星状细胞促进肝细胞凋亡。1)HSC的ALD模型构建。采用不同浓度的乙醛刺激HSC48h,利用细胞增殖试剂盒（CCK-8）测定细胞存活率,Western Blot（WB）测定HSC细胞平滑肌肌动蛋白α（α-SMA）、胶原1（Col1）与纤连蛋白（FN）的表达水平,以评价模型。2)活化HSC与肝细胞的共培养实验。Transwell共培养（活化/静止）HSC与肝细胞,流式细胞术检测肝细胞凋亡率,采用实时荧光定量PCR（qPCR）与WB法检测肝细胞凋亡相关分子Caspase3、Bax与Bcl-2表达水平,验证活化HSC对肝细胞凋亡的作用。（2）活化HSC外泌体miRNA差异表达谱与下游靶基因的筛选。1)用无外泌体培养基/含乙醛的无外泌体培养基分别处理HSC,收集细胞上清液并用超速离心法收集上清液中外泌体。使用电镜、WB、粒径分析的方法对HSC外泌体（HSC-exo）进行鉴定。2)提取静止/活化HSC-exo,利用RNA-seq分析外泌体差异miRNA。|log2（FC）|＞2为标准筛选HSC来源外泌体中的差异表达miRNA。TargetScan软件预测HSC来源外泌体差异表达Let-7b-5p的下游靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证Let-7b-5p与靶基因mRNA互补结合。（3）活化HSC外泌体运转Let-7b-5p促进肝细胞凋亡。1)HSC-exo用PKH26染色后,与肝细胞共同孵育4h,使用荧光显微镜观察拍摄肝细胞摄取HSC-exo。将肝细胞与活化/静止组HSC-exo共同孵育,采用流式细胞术检测肝细胞凋亡,实时定量PCR方法检测肝细胞内 Let-7b-5p,EZH2、Bax、Bcl-2 mRNA水平水平,WB的方法测定肝细胞EZH2、Bax、Bcl-2表达水平,验证活化组HSC-exo对肝细胞凋亡的作用。2)肝星状细胞内转染Let-7b-5p mimics、Let-7b-5p mimic-NC。qPCR方法检测肝星状细胞外泌体内Let-7b-5p;将Let-7b-5p mimic修饰的肝星状细胞外泌体与肝细胞共培养,采用流式细胞术检测肝细胞凋亡水平,qPCR方法检测肝细胞内Let-7b-5p,EZH2、Bax、Bcl-2 mRNA水平水平,WB方法检测EZH2、Bax、Bcl-2的表达水平。（4）调肝理脾颗粒对Let-7b-5p介导的肝细胞凋亡保护作用研究。1)采用不同浓度的调肝理脾方颗粒水溶液处理肝细胞48h小时,采用CCK-8法确定调肝理脾颗粒处理的最佳浓度。2)设立肝细胞NC组,Let-7b-5p过表达组组与中药保护组。中药保护组首先采用调肝理脾方水溶液预防性给药48h,48h后NC组转染Let-7b-5p mimic-NC,Let-7b-5p过表达组与中药保护组组转染Let-7b-5p mimic。使用流式细胞术检测NC组、Let-7b-5p过表达组与中药保护组的凋亡水平,qPCR检测Let-7b-5p,EZH2、Bax、Bcl-2 mRNA 水平,Western Blot 方法检测 EZH2、Bax、Bcl-2 的表达水平。结果:（1）用300μM乙醛刺激HSC 48小时后,HSC的存活率最高,为正常组的1.15倍。WB结果显示,α-SMA、Col1与FN表达水平较正常HSC显著上调,HSC造模成功。（2）流式结果显示:肝细胞与乙醛活化的HSCTranswell共培养后,肝细胞凋亡率显著提高;qPCR与WB结果显示肝细胞Caspase3、Bax mRNA与蛋白表达上调,

关键词：凋亡肝细胞肝星状细胞酒精性肝病调肝理脾方外泌体 Let-7b-5p

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基于m6A甲基化调控因子文献信息构建食管癌预后风险模型

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中华肿瘤防治杂志 2021年第19期28卷 1471-1476页

作者：孙建荣娄彦妮孔晨帆贾立群北京中医药大学临床医学院北京100029 中日友好医院中西医结合肿瘤内科北京100029 上海中医药大学研究生院上海201203 深圳罗湖中医院广东深圳518001

目的构建基于m6A甲基化调控因子的食管癌预后风险模型,并寻找预后生物标志物。方法从TCGA数据库下载食管癌转录组数据和临床资料,提取m6A甲基化调控因子基因表达数据,利用R软件"limma"包进行差异表达分析,采用单因素Cox回归分析筛选预... 详细信息

目的构建基于m6A甲基化调控因子的食管癌预后风险模型,并寻找预后生物标志物。方法从TCGA数据库下载食管癌转录组数据和临床资料,提取m6A甲基化调控因子基因表达数据,利用R软件"limma"包进行差异表达分析,采用单因素Cox回归分析筛选预后有关联的m6A调控因子,多因素Cox回归分析构建食管癌预后风险模型。基于模型计算每位患者的风险评分,并根据风险评分的中位数将患者分为高、低风险组,采用Kaplan-Meier生存分析和ROC曲线对模型效能进行评价。结合临床病理特征,采用Cox回归分析验证该模型在食管癌预后评估中的有效性。结果差异表达分析显示,ALKBH5、KIAA1429、RBM15、YTHDF1、HNRNPC、METTL3、WTAP、YTHDF2和YTHDC1在食管癌组织中高表达,单因素分析结果显示过高表达ALKBH5(HR=0.953,95%CI为0.920~0.987,P=0.01)的食管癌患者预后较好,多因素分析,变量筛选方法选用LR向后剔除法,构建包含4个基因的预后风险模型,Kaplan-Meier生存分析显示高风险组5年总生存率较低风险组差(χ^(2)=5.53,P=0.02),ROC曲线提示模型预测性良好(AUC=0.759)。模型风险评分及临床病理特征纳入Cox回归分析,结果显示高风险评分是食管癌患者预后的唯一独立危险因素。结论采用生物信息学法构建的食管癌预后风险模型,预测能力较好,并确定了一个保护性生物标记物ALKBH5。

关键词：食管癌 m6A甲基化预后模型预后生物标志物生物信息学

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基于可变剪切数据构建食管癌预后风险模型

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肿瘤 2020年第12期40卷 834-845页

作者：孔晨帆孙建荣杨佳潞孙劲晖北京中医药大学研究生院北京100029 北京中医药大学东直门医院消化科北京100700

目的:利用食管癌的可变剪切数据,构建食管癌预后风险模型并建立列线图。方法:分别从癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)SpliceSeq数据库和TCGA数据库下载食管癌的可变剪切数据和食管癌患者的临床资料,将2个数据集合并,得到食... 详细信息

目的:利用食管癌的可变剪切数据,构建食管癌预后风险模型并建立列线图。方法:分别从癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)SpliceSeq数据库和TCGA数据库下载食管癌的可变剪切数据和食管癌患者的临床资料,将2个数据集合并,得到食管癌可变剪切的生存数据。采用单因素COX回归分析筛选与预后相关的可变剪切,为避免模型过度拟合,采用最小绝对值收敛和选择算子(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)回归分析筛选变量;随后将筛选得到的可变剪切纳入多因素COX回归分析构建食管癌的预后风险模型。基于该模型计算每位患者的风险评分并根据风险评分的中位数将患者分为高风险组和低风险组,采用Kaplan-Meie进行生存分析和受试者接受特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线对模型效能进行评价。最终将风险模型与临床病理特征合并,采用COX回归分析探究食管癌的独立预后因素并建立列线图。采用一致性指数(concordance index,C-index)、校准图和决策曲线来评价列线图的预测准确度。结果:从TCGA SpliceSeq和TCGA数据库下载得到185例食管癌患者的可变剪切数据和临床资料。采用单因素COX回归分析筛选得到2389个与食管癌预后相关的可变剪切,随后采用Lasso回归分析筛选得到17个可变剪切,使用多因素COX回归分析建立了基于10个基因(CHRDL2、ERBB2、IAH1、C16orf13、C19orf82、RNF150、PNKP、ZNF467、TMPRSS4和HPS1)的可变剪切的食管癌预后风险模型。基于模型风险评分,将样本分为高风险组和低风险组;Kaplan-Meier生存分析显示,高风险组的总生存(overall survival,OS)率较低风险组差(P<0.05),ROC分析结果提示,该食管癌预后风险模型预测性良好[曲线下面积(area under curve,AUC)=0.865]。COX回归分析结果显示,病理分期和风险评分是食管癌的独立预后因子。结合这些预后因子构建的列线图显示出较好的区分度(C-index为0.79;95%可信区间为0.752~0.843),校准曲线及决策曲线提示该列线图具有较好的预测食管癌患者OS期的能力。结论:基于可变剪切的预后风险模型能够明显区分高风险和低风险组食管癌患者的生存率。基于模型风险评分及病理分期构建的列线图能够有效地预测食管癌患者的OS率。

关键词：食管肿瘤 RNA加工,转录后可变剪切预后决策支持技术列线图

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酒精性肝纤维化的中医治疗思路

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中西医结合肝病杂志 2022年第2期32卷 167-169页

作者：张欢孔晨帆杨佳潞周艳彩孙劲晖北京中医药大学东直门医院消化科北京100700

酒精性肝纤维化是长期过量饮酒,肝细胞受乙醇及其代谢产物持续性损伤出现变性坏死或损伤后修复过程中的代偿反应,细胞外基质大量沉积于肝脏为其主要病理特征[1,2]。据统计,中国酒精性肝病(ALD)人数正以惊人的速度上升,非病毒性肝炎肝硬... 详细信息

酒精性肝纤维化是长期过量饮酒,肝细胞受乙醇及其代谢产物持续性损伤出现变性坏死或损伤后修复过程中的代偿反应,细胞外基质大量沉积于肝脏为其主要病理特征[1,2]。据统计,中国酒精性肝病(ALD)人数正以惊人的速度上升,非病毒性肝炎肝硬化患者中ALD所占比例最高,已成为我国最主要的慢性肝病之一[3,4]。酒精性肝纤维化是进展为肝硬化、肝癌的必然阶段,临床与实验研究发现,其具有可逆转性,早期干预对阻断病情发展及延缓病程有十分重要的意义[5,6]。

关键词：酒精性肝纤维化酒癖辨证论治

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龙胆苦苷对过氧化氢诱导HepG2细胞氧化应激损伤的保护作用研究

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世界中西医结合杂志 2019年第11期14卷 1530-1534页

作者：肖琨珉孔晨帆姚树坤北京中医药大学北京100029 中日友好医院北京100029

目的对龙胆苦苷对过氧化氢(H 2O 2)所致HepG2细胞氧化损伤的作用及其机制进行研究。方法以800μmol/L H2O2损伤细胞6 h建立模型;CCK8法检测细胞存活率选取龙胆苦苷10、20、40μmol/L作为干预剂量;实验分为5组,即正常组、模型组和龙胆苦... 详细信息

目的对龙胆苦苷对过氧化氢(H 2O 2)所致HepG2细胞氧化损伤的作用及其机制进行研究。方法以800μmol/L H2O2损伤细胞6 h建立模型;CCK8法检测细胞存活率选取龙胆苦苷10、20、40μmol/L作为干预剂量;实验分为5组,即正常组、模型组和龙胆苦苷低、中、高剂量组,诱导成功后用微量法检测细胞内MDA含量变化,荧光共聚焦检测细胞内ROS水平,运用Westem blot法检测各组细胞Nrf2蛋白的表达,以及对细胞中Nrf2激活的分子机制进行硏究。结果与正常组比较,模型组MDA含量、ROS水平增加(P<0.05),Nrf2蛋白表达量明显下调(P<0.05)。与模型组比较,龙胆苦苷高剂量组MDA含量显著降低(P<0.05),Nrf2蛋白表达量明显上调(P<0.05)。结论龙胆苦苷预处理可提高细胞存活率,促进Nrf2核转移,Nrf2的表达变化与P13K/AKT通路有关,可增强体内抗氧化性应激系统、清除氧自由基、降低细胞凋亡。

关键词：龙胆苦苷 HepG2细胞氧化应激 Nrf2 P13K/AKT

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仙人掌鲜品联合耳穴压丸治疗轻度痤疮疗效观察

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西部中医药 2019年第3期32卷 108-111页

作者：夏弋钦李梦真孔晨帆吴凤芝北京中医药大学北京100029

目的:观察仙人掌鲜品联合耳穴压丸治疗大学生轻度痤疮的临床疗效。方法:将大学生轻度痤疮患者70例随机分为试验组、对照组各35例,试验组用仙人掌鲜品联合耳穴压丸治疗,对照组用仙人掌鲜品治疗,治疗第1周、第3周和第6周采用痤疮综合分级... 详细信息

目的:观察仙人掌鲜品联合耳穴压丸治疗大学生轻度痤疮的临床疗效。方法:将大学生轻度痤疮患者70例随机分为试验组、对照组各35例,试验组用仙人掌鲜品联合耳穴压丸治疗,对照组用仙人掌鲜品治疗,治疗第1周、第3周和第6周采用痤疮综合分级系统量表(GAGS)评定痤疮皮损程度,应用面部痤疮患者特异性生活质量(Qol-acne)量表评价患者治疗前后生活质量。结果:2组患者痤疮皮损分值均下降,试验组GAGS量表总分低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);2组患者第6周Qol-acne量表得分均高于基线得分,试验组总分差值高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:仙人掌鲜品联合耳穴治疗痤疮效果优于单用仙人掌鲜品。

关键词：轻度痤疮 GAGS Qol-acne量表耳穴压丸仙人掌鲜品

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基于痰瘀毒病机探讨细胞焦亡与酒精性肝病的关系

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中医药学报 2022年第5期50卷 1-4页

作者：周艳彩孔晨帆杨佳潞朱晓东金承烨孙劲晖北京中医药大学北京100029 上海中医药大学上海201201 北京中医药大学东直门医院北京100700

细胞焦亡是近年来新发现的一种有别于细胞坏死、凋亡、自噬的细胞程序性死亡的新形式。酒精性肝病(ALD)是长期饮酒过量导致慢性酒精中毒的主要表现之一。目前研究证实细胞焦亡涉及ALD的发病机制为酒精诱导的肝细胞炎症小体通路激活促进... 详细信息

细胞焦亡是近年来新发现的一种有别于细胞坏死、凋亡、自噬的细胞程序性死亡的新形式。酒精性肝病(ALD)是长期饮酒过量导致慢性酒精中毒的主要表现之一。目前研究证实细胞焦亡涉及ALD的发病机制为酒精诱导的肝细胞炎症小体通路激活促进肝细胞的焦亡。此机制与中医“痰瘀毒”导致ALD的发病机制有其相似之处。因此,从“痰瘀毒”病机探讨细胞焦亡在ALD中的发病分子机制,有望为ALD的治疗提供新的临床指导原则。

关键词：细胞焦亡酒精性肝病痰瘀毒

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基于网络药理学探讨茵陈蒿汤治疗肝纤维化的作用机制

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中医药学报 2021年第6期49卷 29-36页

作者：朱晓东邸学士杨佳潞周艳彩金承烨孔晨帆孙劲晖北京中医药大学北京100029 北京中医药大学东直门医院北京100700

目的:通过网络药理学的方法,探讨茵陈蒿汤治疗肝纤维化可能的药理作用机制。方法:通过TCMSP数据库获取茵陈蒿汤主要活性成分,通过SwissTargetPrediction平台进行成分靶标预测;经GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库获取肝纤维化相关靶点,... 详细信息

目的:通过网络药理学的方法,探讨茵陈蒿汤治疗肝纤维化可能的药理作用机制。方法:通过TCMSP数据库获取茵陈蒿汤主要活性成分,通过SwissTargetPrediction平台进行成分靶标预测;经GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库获取肝纤维化相关靶点,与中药成分靶点取交集,获得茵陈蒿汤治疗肝纤维化的潜在作用靶点;应用Cytoscape软件构建中药-活性成分-交集靶点网络图,使用String数据库进行蛋白质相互作用(PPI)网络分析,依据度中心性大小筛选关键靶点;通过DAVID平台对关键靶点进行GO和KEGG富集分析,以探究茵陈蒿汤治疗肝纤维化的药理作用机制。结果:筛选出茵陈蒿汤活性成分44个,包括槲皮素、β谷甾醇、异鼠李素等核心成分;茵陈蒿治疗肝纤维化的潜在作用靶点174个;对交集靶点进行蛋白质互相作用网络分析获取关键靶点63个,包括MAPK1、PIK3CA、SRC、PIK3R1、MAPK3、AKT1等核心靶点;关键靶点基因的GO及KEGG富集分析显示:关键靶标主要在细胞核、细胞质、胞浆、质膜及核质等位置发挥作用,通过信号传导、凋亡过程负调节、细胞增殖正调节及RNA聚合酶II启动子转录的正调控等生物过程,发挥与蛋白质结合、ATP结合、蛋白激酶活性及蛋白酪氨酸激酶活性等功能。关键靶点主要通过参与PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、VEGF信号通路等对肝纤维化进行调控。结论:茵陈蒿汤中槲皮素、β谷甾醇、异鼠李素等核心成分,可能通过参与PI3K-Akt、Ras、VEGF等信号通路,作用于MAPK1、PIK3CA、SRC等基因靶点,发挥抗纤维化作用。

关键词：肝纤维化茵陈蒿汤网络药理学信号通路

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从肝肺同调论治泄泻

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中医药学报 2021年第12期49卷 60-63页

作者：杨佳潞孔晨帆周艳彩朱晓东金承烨孙劲晖孙岸弢北京中医药大学北京100029 北京中医药大学东直门医院北京100700 中国中医科学院广安门医院北京100053

泄泻是指大便次数增多,粪质稀薄,甚至泻出如水样为主要症状的疾病。本文从风、湿、气、虚四个环节论述泄泻病机,治疗上注重调肝理肺,以期通过调节气机升降,使脾胃功能正常运行。基于圆运动理论,使人身之气从病态循行恢复到常态运行,以... 详细信息

泄泻是指大便次数增多,粪质稀薄,甚至泻出如水样为主要症状的疾病。本文从风、湿、气、虚四个环节论述泄泻病机,治疗上注重调肝理肺,以期通过调节气机升降,使脾胃功能正常运行。基于圆运动理论,使人身之气从病态循行恢复到常态运行,以达到轮运复轴的作用。从而为临床治疗泄泻提供新的治疗思路。

关键词：泄泻肝肺同调风湿气虚

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