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抗人肝癌基因工程嵌合抗体的构建及在Sp2/0细胞的稳定表达

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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第6期24卷 480-483页

作者：邢金良杨向民宋斐姚西英陈志南第四军医大学基础部细胞工程研究中心西安710032

目的　构建抗人肝癌嵌合抗体 ,并在Sp2 0细胞中进行稳定高效表达。方法　分别将HAb18轻、重链可变区基因克隆入真核表达载体pDHL构建重组载体pDHL chHAb18。酶切及测序鉴定后 ,转染Sp2 0细胞 ,经甲氨蝶蛉 (MTX)筛选获得抗性克隆。采... 详细信息

目的　构建抗人肝癌嵌合抗体 ,并在Sp2 0细胞中进行稳定高效表达。方法　分别将HAb18轻、重链可变区基因克隆入真核表达载体pDHL构建重组载体pDHL chHAb18。酶切及测序鉴定后 ,转染Sp2 0细胞 ,经甲氨蝶蛉 (MTX)筛选获得抗性克隆。采用有限稀释法单克隆化后持续MTX加压培养。通过ELISA筛选高效表达的单克隆细胞株。表达产物纯化后 ,进行SDS PAGE和Westernblot检测 ,同时采用ELISA和免疫荧光法检测其抗原结合特异性。结果　成功构建了重组嵌合IgG抗体chHAb18的真核表达载体pDHL chHAb18。转化Sp2 0细胞后 ,初步筛选得到了高效表达chHAb18的细胞株。经MTX加压培养 ,1株细胞的chHAb18表达量达到 10mg L。SDS PAGE和Westernblot检测结果表明 :目的蛋白分子质量约为 16 0× 10 3,还原后为 2条带 ,分子质量约为 5 2× 10 3和 2 7× 10 3。上述蛋白条带均与羊抗人IgG抗体特异结合。结论　成功构建了抗人肝癌基因工程嵌合抗体chHAb18,并在骨髓瘤细胞中获得高效表达。为其进一步的应用研究奠定了基础。

关键词：抗人肝癌基因工程抗体 sp2/0细胞基因表达生物学活性

抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体的原核表达及复性

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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第3期24卷 189-193页

作者：邢金良杨向民姚西英宋斐陈志南第四军医大学基础部细胞工程研究中心西安710032

目的　分别在大肠杆菌中高效表达嵌合Fd及嵌合轻链 ,并进行嵌合Fab复性的研究。方法　分别将嵌合Fd及嵌合轻链基因插入到原核表达载体pET32a中 ,构建成重组载体pET32a/cFd和pET32a/cL。转化大肠杆菌后诱导其表达。大量制备表达的嵌合Fd... 详细信息

目的　分别在大肠杆菌中高效表达嵌合Fd及嵌合轻链 ,并进行嵌合Fab复性的研究。方法　分别将嵌合Fd及嵌合轻链基因插入到原核表达载体pET32a中 ,构建成重组载体pET32a/cFd和pET32a/cL。转化大肠杆菌后诱导其表达。大量制备表达的嵌合Fd及嵌合轻链后 ,按二者绝对量等摩尔比混合后进行透析复性。然后 ,分别利用SDS PAGE、Westernblot和ELISA进行分析和鉴定。结果　成功获得了嵌合Fd及嵌合轻链的原核非融合高效表达 ,表达蛋白相对分子质量 (Mr)均在 2 4×10 3 左右。表达量分别约占菌体总蛋白的 2 8.3%和 32 .3% ,2种目的蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在。另外 ,嵌合Fd与嵌合轻链在缓慢透析的条件下成功地复性为嵌合Fab抗体 ,Mr 约为 4 2×10 3 ,具有特异性抗原结合活性和良好的亲和力。在起始总蛋白浓度为 10 0 μg/ml时 ,复性效率约为4 9 %。结论　成功实现了嵌合Fab抗体的高效表达及高效复性。

关键词：肝癌基因工程嵌合Fab 抗体原核表达载体大肠杆菌基因疗法

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免疫亲和层析纯化大肠癌相关抗原

细胞与分子免疫学杂志 2004年第3期20卷 348-351页

作者：杨勇李郁王贤辉商澎汪莉骞爱荣姚西英陈志南第四军医大学基础部细胞生物学教研室陕西西安710032

目的 :从培养的大肠癌细胞Hce 86 93中分离纯化并鉴定大肠癌相关抗原。方法 :利用流式细胞术选择高表达大肠癌相关抗原的大肠癌细胞系 ,分别用单去污及三去污裂解液裂解细胞。然后用 5株抗大肠癌单克隆抗体 (mAb)CYL 1～CYL 5进行Wester... 详细信息

目的 :从培养的大肠癌细胞Hce 86 93中分离纯化并鉴定大肠癌相关抗原。方法 :利用流式细胞术选择高表达大肠癌相关抗原的大肠癌细胞系 ,分别用单去污及三去污裂解液裂解细胞。然后用 5株抗大肠癌单克隆抗体 (mAb)CYL 1～CYL 5进行Westernblot,分析与大肠癌细胞结合反应最强的mAb。以此mAb作为配基进行亲和层析纯化大肠癌相关抗原 ,纯化结果利用Westernblot法进行鉴定。结果 :大肠癌细胞系Hce 86 93上相关抗原的表达量最高 ;抗大肠癌mAbCYL 2与Hce 86 93的结合力最强。纯化所获与CYL 2特异结合的大肠癌相关抗原 ,Mr 约为 13× 10 3 。该抗原由Mr 为 6 0× 10 3 和70× 10 3 两种亚基组成。结论 :利用mAbCYL 2进行亲和层析 ,从大肠癌细胞系Hce 86 93中获得纯化的肿瘤相关抗原。

关键词：大肠癌抗原亲和色谱法单克隆抗体

抗人HAb18G分子单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的分泌表达

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中国免疫学杂志 2003年第7期19卷 479-482页

作者：邢金良杨向民王永庆姚西英陈志南第四军医大学基础部细胞工程研究中心西安710032

目的 :构建抗人HAb18G分子单链抗体基因 ,并在大肠杆菌中进行分泌表达。方法 :通过连接肽 (Gly4Ser) 3基因序列将已成功克隆的抗人肝癌单抗HAb18轻、重链可变区基因拼接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并在 5′和 3′端引入相应的酶切位点 ,克... 详细信息

目的 :构建抗人HAb18G分子单链抗体基因 ,并在大肠杆菌中进行分泌表达。方法 :通过连接肽 (Gly4Ser) 3基因序列将已成功克隆的抗人肝癌单抗HAb18轻、重链可变区基因拼接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并在 5′和 3′端引入相应的酶切位点 ,克隆至改造的分泌性表达载体pCANTAB 5His之中 ,转化到E coliHB2 15 1中进行诱导表达。亲和层析纯化表达蛋白后 ,以SDS PAGE电泳、Westernblot及ELISA等方法分析检测表达产物。结果 :经限制性酶切鉴定及DNA测序分析 ,证实基因构建正确。SDS PAGE电泳和Westernblot分析表明ScFv基因在大肠杆菌中成功表达。表达产物的相对分子质量 (Mr)为 31kD ,与理论预期值相符 ,并且可与相应的抗原特异结合。结论 :成功实现了抗人HAb18G分子单链抗体的原核分泌表达 ,为其在人肝癌诊治中的进一步应用奠定了基础。

关键词：抗人HAbl8G分子单链抗体基因大肠杆菌分泌表达

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把学员队工作的着力点放到跨世纪人才培养上

山西医科大学学报（基础医学教育版） 1999年第4期1卷 58-59页

作者：姚西英曾锦川第四军医大学

新世纪对医学生提出了更高标准，怍为管理学员的各级干部要瞄准目标，改进方法，把工作重点放在学员创新能力、科学精神、全面素质培养上。

关键词：学员队全面素质培养人才培养着力点科学精神创新能力工作重点医学生改进方法干部

扩张柱床吸附层析回收纯化灌流培养生产的单克隆抗体

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生物工程学报 2004年第2期20卷 227-232页

作者：余晓玲米力姚西英陈志南第四军医大学细胞工程研究中心国家863计划西安细胞工程基地陕西西安710032

用扩张柱床吸附层析技术 ,一步回收纯化连续灌流培养的单克隆抗体。用StreamlineSP阳离子交换介质在固定床柱XK16 2 0上进行条件摸索 ,扩张床柱Streamline 2 5和 50分别用于小规模条件优化和中试规模放大。培养液中的低浓度单抗经此步处... 详细信息

用扩张柱床吸附层析技术 ,一步回收纯化连续灌流培养的单克隆抗体。用StreamlineSP阳离子交换介质在固定床柱XK16 2 0上进行条件摸索 ,扩张床柱Streamline 2 5和 50分别用于小规模条件优化和中试规模放大。培养液中的低浓度单抗经此步处理 ,浓缩 10倍以上 ,纯度提高 5～ 7倍 ,回收率 >90 % ,制备周期比固定柱床层析缩短一半以上。根据培养液中单抗浓度的不同 ,一次处理量为 18～ 50L ,纯化规模由实验室水平 (40 0mg)扩大至中试水平(2g) ,生产成本和工艺复杂性大为降低。应用扩张柱床吸附层析技术 ,建立单克隆抗体回收纯化工艺 ,具有经济、简便。

关键词：扩张柱床吸附层析技术纯化工艺灌流培养单克隆抗体培养液

对生物医学研究生开设生物医学实验安全课程的必要性探讨

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山西医科大学学报（基础医学教育版） 2004年第1期6卷 69-71页

作者：蒋建利姚西英第四军医大学细胞工程研究中心

通过对当前生物医学发展与生物安全现状分析,探讨在生物医学研究生课程中设置生物医学实验安全课程的必要性.

关键词：实验安全课程必要性开设现状分析生物医学研究生物安全发展

稳定表达肝癌相关抗原HAb18G/CD147成纤维细胞株的建立及其意义

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第四军医大学学报 2004年第8期25卷 673-676页

作者：黄勇蒋建利周筠姚西英窦科峰陈志南第四军医大学西京医院肝胆外科陕西西安710033 第四军医大学基础部细胞工程研究中心陕西西安710033

目的 :探讨将HAb1 8G全长cDNA转染成纤维细胞NIH/ 3T3的可行性及其意义 .方法 :将含有肝癌相关抗原HAb1 8G全长cDNA的真核表达载体 pcDNA3.0 /HAb1 8G利用脂质体介导法转染小鼠成纤维细胞NIH/ 3T3,G4 1 8筛选建立稳定表达阳性克隆细胞株... 详细信息

目的 :探讨将HAb1 8G全长cDNA转染成纤维细胞NIH/ 3T3的可行性及其意义 .方法 :将含有肝癌相关抗原HAb1 8G全长cDNA的真核表达载体 pcDNA3.0 /HAb1 8G利用脂质体介导法转染小鼠成纤维细胞NIH/ 3T3,G4 1 8筛选建立稳定表达阳性克隆细胞株t3T3;利用流式细胞仪、间接免疫荧光染色方法鉴定目的蛋白转染情况 ;RT PCR琼脂糖电泳、明胶酶谱分别从mRNA和蛋白水平检测转染前后HAb1 8G刺激 3T3细胞分泌基质金属蛋白酶 (MMP 2、MMP 9)的情况 .结果 :利用脂质体介导法将HAb1 8G全长cDNA转染入成纤维细胞NIH/ 3T3,G4 1 8筛选 ,流式细胞仪分析、间接免疫荧光染色证实成功建立了稳定表达HAb1 8G的阳性克隆株 ;RT PCR琼脂糖电泳证实t3T3细胞MMP 2、MMP 9mRNA转录水平较未转染前增多 ;明胶酶谱表明t3T3分泌MMPs能力较未转染前增强 .结论 :HAb1 8G全长cDNA可以稳定转染成纤维细胞 ,并能从核酸和蛋白水平诱导基质金属蛋白酶高表达。

关键词：转染抗原,肿瘤 HAbl8G 成纤维细胞金属蛋白酶类

抗人大肠癌抗体CAb-1 Fab基因的克隆、表达和鉴定

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第四军医大学学报 2004年第19期25卷 1768-1771页

作者：杨向民邢金良姚西英张思河陈志南第四军医大学基础部细胞工程研究中心陕西西安710033

目的 :从杂交瘤细胞中克隆mAbCAb 1所编码Fab抗体基因 ,并在大肠杆菌中进行表达和鉴定 .方法 :采用RT PCR方法 ,扩增mAbCAb 1的Fd片段和全长κ链基因 ,分别克隆到T载体后进行序列测定和分析 .依次亚克隆两个基因到噬粒 pComb3中 ,去除... 详细信息

目的 :从杂交瘤细胞中克隆mAbCAb 1所编码Fab抗体基因 ,并在大肠杆菌中进行表达和鉴定 .方法 :采用RT PCR方法 ,扩增mAbCAb 1的Fd片段和全长κ链基因 ,分别克隆到T载体后进行序列测定和分析 .依次亚克隆两个基因到噬粒 pComb3中 ,去除该载体上的 gIII基因 ,构建成分泌表达载体Fd L/pComb3.转化XL1 BlueE .coli菌株 ,IPTG诱导表达 .采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性 .结果 :克隆了大肠癌mAbCAb 1的Fab基因 ,并在E .coli中获得表达 .产物CAb 1Fab具有与大肠癌细胞株SW4 80特异结合的活性 .结论 :成功构建了在E .coli中表达抗人大肠癌mAbCAb 1的小分子单价Fab抗体的载体 .

关键词：结直肠肿瘤 Fab抗体克隆表达