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作者：姚晨成上海交通大学

学位级别：硕士

研究背景与目的:人的精子发生过程包括精原细胞的有丝分裂、精母细胞的减数分裂以及精子细胞的变形过程。人睾丸的支持细胞（Sertoli cells）是人生精小管中唯一的体细胞,它不仅参与构成血睾屏障,而且,可以释放出大量的生长因子来维持... 详细信息

研究背景与目的:人的精子发生过程包括精原细胞的有丝分裂、精母细胞的减数分裂以及精子细胞的变形过程。人睾丸的支持细胞（Sertoli cells）是人生精小管中唯一的体细胞,它不仅参与构成血睾屏障,而且,可以释放出大量的生长因子来维持人精子发生的顺利进行。精子发生是一个非常复杂的过程,受到各种遗传因素、表观遗传因素以及所处微环境的影响。在啮齿动物中,有大量研究表明非编码小RNA（microRNA）对正常精子发生具有重要调控作用,其功能异常可导致精子发生的异常。但是,microRNA在正常人睾丸组织和非梗阻性无精子症的精原细胞、精母细胞以及精子细胞的表达谱差异,以及它对正常人支持细胞中的作用及其机制还未见报道。因此,本学位论文的研究目的有:1)首次大规模比较了梗阻性无精子症（OA）和唯支持细胞综合症（SCOS）患者睾丸组织的支持细胞的microRNA差异表达谱;2)研究了miRNA-133b对人支持细胞中的功能和调控靶标;3)我们对梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症的精原细胞、精母细胞以及精子细胞的大规模差异谱进行了对比、验证和生物信息学分析。方法:第一部分:microRNA在正常人睾丸组织和非梗阻性无精子症的支持细胞差异表达、miRNA-133b对人支持细胞的作用及其机制。首先,利用microRNA芯片以及实时定量PCR筛选和验证梗阻性无精子症和唯支持细胞综合症患者的睾丸组织支持细胞的差异表达microRNA。运用miRNA-133b的特异激动剂和抑制剂、CCK-8方法以及蛋白印迹技术,检测了miRNA-133b其对人支持细胞增殖的影响;采用免疫组织化学技术比较了梗阻性无精子症和唯支持细胞综合症患者睾丸组织中支持细胞的增殖状况。利用生物信息学预测miRNA靶标,并用实时定量PCR、miRNA-133b激动剂和抑制剂以及蛋白印迹技术进一步验证了其靶标;最后,我们利用siRNA技术及CCK-8方法进一步研究了该靶标对支持细胞增殖的功能。第二部分:microRNA在正常人睾丸组织和非梗阻性无精子症的精原细胞、粗线期精母细胞以及圆形精子细胞的表达谱差异。利用两步酶消化、差异贴壁以及STA-PUT梯度沉降方法分选出梗阻性无精子症患者以及非梗阻性无精子症患者睾丸组织的精原细胞、粗线期精母细胞以及圆形精子细胞。将梗阻性无精子症患者和非梗阻性无精子症的各种生殖细胞5人一组混合成一个样本,抽提RNA,经RNA扩增后进行RNA深度测序,随机选取了11种microRNA进行了验证,利用生物信息学预测了这些microRNA的靶标,并利用实时定量PCR进一步验证了其靶标。结果:第一部分:利用两步酶法和差异贴壁的方法分离出人睾丸组织支持细胞,免疫细胞化学显示,所分离的细胞表达GATA4、WT1、SOX9、BMP4、SCF和GDNF等蛋白,表明这些细胞具有人支持细胞的生化表型。microRNA芯片显示,174种microRNA在梗阻性无精子症与唯支持细胞综合症患者支持细胞的表达差异显著,其中,在唯支持细胞综合症患者支持细胞中有88种microRNA表达上调,有86种microRNA表达下调;实时定量PCR验证了microRNA芯片发现的部分差异表达microRNA。miRNA-133b模拟物可以促进人支持细胞的增殖,相反,其抑制剂可以降低人支持细胞的增殖。免疫组织化学显示,在唯支持细胞综合症患者的睾丸组织中有更多的支持细胞处于增殖状态。实时定量PCR以及蛋白印迹表明,GLI3是miRNA-133b的直接靶标;miRNA-133b通过增强细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白D1的表达而促进支持细胞的增殖。RNA干扰技术可降低支持细胞GLI3基因与蛋白表达水平,CCK-8显示下调GLI3的表达可促进人支持细胞的增殖。第二部分:利用两步酶消化、差异贴壁以及STA-PUT方法分离梗阻性无精子症（OA）和非梗阻性无精子症患者（NOA）睾丸组织的精原细胞、粗线期精母细胞以及圆形精子细胞,并对其形态学表型进行了鉴定。提取OA及NOA患者的各级生殖细胞RNA和RNA深度测序显示,在NOA患者的各级生殖细胞中microRNA普遍高表达,而pi RNA低表达。我们着重比较了OA与NOA患者的精原细胞的microRNA表达谱差异。对比OA与NOA精原细胞,76种miRNA在OA精原细胞中表达,而在NOA精原细胞不表达,88种miRNA在OA的精原细胞中表达高于NOA的精原细胞;91种miRNA在NOA的精原细胞中表达,而在OA的精原细胞不表达,308种miRNA在NOA的精原细胞中表达高于OA的精原细胞。我们随机选取了11种microRNA进行了验证,并利用生物信息学预测了其靶标,实时定量PCR结果验证了差异表达miRNA及其靶标在OA和NOA精原细胞的表达差异。结论:本学位论文研究通过

关键词： microRNA 差异表达谱靶标梗阻性与非梗阻性无精子症支持细胞 miRNA-133b GLI3 细胞增殖生殖细胞

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机器人4K3D手术可视化系统的成像质量及其在显微精道复通动物模型中的应用

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中华男科学杂志 2022年第2期28卷 122-128页

作者：陈慧兴李朋姚晨成李铮上海交通大学附属第一人民医院临床泌尿外科中心上海200080

目的:量化评测机器人4K3D手术可视化系统(Zeiss,KINEVO 900)在视觉成像效果方面的性能,评估其在显微精道复通术中的应用价值。方法:平行比较分析KINEVO 900和光学手术显微镜(Zeiss,S7)的平面及立体视觉图像效果,运用KINEVO 900在大鼠上... 详细信息

目的:量化评测机器人4K3D手术可视化系统(Zeiss,KINEVO 900)在视觉成像效果方面的性能,评估其在显微精道复通术中的应用价值。方法:平行比较分析KINEVO 900和光学手术显微镜(Zeiss,S7)的平面及立体视觉图像效果,运用KINEVO 900在大鼠上施行显微精道复通手术操作。结果:与S7相比较而言,KINEVO 900工作距离范围更大(200~625 mm);在同样的工作距离(200 mm)下,有效术野面积是S7的3~4倍;前景深是S7的1.5~2倍。运用两者实施显微精道复通术,平均吻合时间和术后即刻通畅率无明显差异(P>0.05)。结论:KINEVO 900输出4K3D视频数字图像并不逊色于以S7为代表的光学手术显微镜,可以满足目前泌尿男科显微手术的需求,后续仍需前瞻性随机临床动物实验研究进一步评估其在泌尿男科的应用价值。

关键词：手术显微镜可视化系统景深精道吻合

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KIFC1在精子顶体形成过程中的时空表达特征及其功能研究

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中华男科学杂志 2019年第12期25卷 1059-1065页

作者：智二磊李朋姚晨成汪小波洪燕李铮上海交通大学附属第一人民医院男科

目的:探讨C末端驱动蛋白1(KIFC1)在精子顶体形成过程中的时空表达特征及其功能。方法:利用流式分选及免疫荧光技术,分析KIFC1在精子顶体形成过程中的表达和定位。运用体外GC2-spd细胞系筛选出具有高干扰效率的KIFC1的小干扰RNA(RNAi1),... 详细信息

目的:探讨C末端驱动蛋白1(KIFC1)在精子顶体形成过程中的时空表达特征及其功能。方法:利用流式分选及免疫荧光技术,分析KIFC1在精子顶体形成过程中的表达和定位。运用体外GC2-spd细胞系筛选出具有高干扰效率的KIFC1的小干扰RNA(RNAi1),将混有0.5%台盼蓝的KIFC1 RNAi1,显微注射至3周龄Balb/c小鼠的睾丸生精小管内,同一只对侧睾丸注射阴性Con-RNAi;在注射后3周后,取附睾尾部精子进行形态学分析。结果:精子变形早期,KIFC1蛋白主要表达于精子细胞的细胞质中;变形中期,KIFC1蛋白表达于顶体泡及顶体;变形晚期,KIFC1蛋白主要表达于残余体内;成熟期,KIFC1蛋白在精子表达消失。RNAi1组的精子头部畸形率明显高于对照[(32.12±0.25)%vs(7.06±1.25)%,P成过程中可能发挥重要作用,主要影响精子顶体的形成。

关键词： C末端驱动蛋白1 顶体形成小干扰RNA 睾丸显微注射

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梗阻性无精子症再次精道显微重建术策略分析——附21例报道

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中华生殖与避孕杂志 2022年第4期42卷 394-398页

作者：赵晶鹏李朋陈慧兴田汝辉智二磊黄煜华姚晨成李铮上海交通大学附属第一人民医院泌尿外科临床医学中心男科上海交通大学泌尿外科研究所男性健康评估中心上海200080 南京医科大学附属上海一院临床医学院上海200080

目的探讨梗阻性无精子症患者初次输精管道显微吻合术失败后再次显微重建手术的有效性和安全性。方法本研究为回顾性病例系列研究, 分析了因初次显微镜下输精管道重建手术失败, 2015年3月至2020年6月期间于上海交通大学医学院附属第一人... 详细信息

目的探讨梗阻性无精子症患者初次输精管道显微吻合术失败后再次显微重建手术的有效性和安全性。方法本研究为回顾性病例系列研究, 分析了因初次显微镜下输精管道重建手术失败, 2015年3月至2020年6月期间于上海交通大学医学院附属第一人民医院泌尿外科临床医学中心男科行再次手术治疗的21例梗阻性无精子症患者的病例资料, 术后随访患者症状缓解或复通及妊娠情况。结果 21例患者中, 8例初次手术为输精管输精管吻合术, 8例为输精管附睾吻合术, 5例为交叉吻合术;2例因输精管结扎术后睾丸疼痛行手术治疗, 19例因生育需求行手术治疗。再次手术探查发现14例原吻合口狭窄, 6例吻合口有精子肉芽肿形成, 1例术中证实为非梗阻性无精子症。19例成功行单侧或双侧输精管道吻合术, 1例患者因原术区粘连严重而未能行再次吻合, 行睾丸取精术;1例术中证实为非梗阻性无精子症患者行睾丸显微取精术。术后随访(30.2±18.4)个月, 范围为3~58个月, 2例失访。术后随访显示, 输精管结扎后睾丸疼痛患者1例阴囊症状完全缓解, 1例部分缓解;术后11例再通成功, 4例自然妊娠, 2例患者尚未复查精液。3例患者通过辅助生殖技术成功妊娠(1例使用新鲜精液精子, 2例使用术中冻存睾丸精子)。所有患者术中、术后均未出现并发症。结论对于初次显微重建手术失败的梗阻性无精子症患者, 再次输精管道重建手术安全可靠, 可获得满意的术后复通率和自然妊娠率。

关键词：梗阻性无精子症再次手术显微外科手术男性不育

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从无到有:构建精子发生障碍诊疗体系

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上海医学 2022年第7期45卷 458-460页

作者：欧宁静姚晨成李铮上海交通大学医学院附属第一人民医院泌尿男科上海生殖医学重点实验室上海200080

精子发生障碍导致男性不育与出生缺陷已影响全国至少500万家庭。由于缺少基于临床家系的致病基因遗传与表观遗传研究,以及缺少充足睾丸组织样本量支持的应用研究,男性不育的发病机制至今未被阐明。男性不育的临床诊疗缺少核心的关键诊... 详细信息

精子发生障碍导致男性不育与出生缺陷已影响全国至少500万家庭。由于缺少基于临床家系的致病基因遗传与表观遗传研究,以及缺少充足睾丸组织样本量支持的应用研究,男性不育的发病机制至今未被阐明。男性不育的临床诊疗缺少核心的关键诊疗技术,更无完整的诊疗体系。本研究团队通过构建临床样本数据库,制订一系列男性不育临床诊疗共识,提出诊疗新路径;进一步聚焦精子发生障碍与精原干细胞增殖分化机制研究,开发关键技术,应用于男性不育的精准诊断与治疗。

关键词：精子发生障碍不育,男性显微手术取精精子冻存

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精子发生障碍导致男性不育的基础研究及其临床应用

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上海医学 2019年第7期42卷 429-430页

作者：李铮何祖平张锋夏术阶姚晨成袁青青田汝辉朱子珏智二磊李朋上海交通大学附属第一人民医院泌尿外科临床医学中心上海生殖医学重点实验室上海200080 上海交通大学医学院附属仁济医院干细胞研究中心复旦大学附属妇产科医院人类精子库

精子发生障碍导致严重精子畸形与无精子症,由此引起的不育症与出生缺陷至少影响500万家庭。目前人类对生精障碍发病机制的认识有限,仅认识到Klinefelter综合征、Y染色体微缺失、隐睾、腮腺炎性睾丸炎影响精子发生。由遗传、环境、生活... 详细信息

精子发生障碍导致严重精子畸形与无精子症,由此引起的不育症与出生缺陷至少影响500万家庭。目前人类对生精障碍发病机制的认识有限,仅认识到Klinefelter综合征、Y染色体微缺失、隐睾、腮腺炎性睾丸炎影响精子发生。由遗传、环境、生活方式导致精子发生障碍的研究,多集中于啮齿类动物,缺乏对人类精原干细胞增殖分化的研究,尤其对调控信号的分子通路所知不多。

关键词：精子发生障碍精子形成男性不育生精小管生精障碍

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梗阻性无精子症患者ICSI助孕失败后精道显微重建术可行性与安全性分析——附20例报道

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中华生殖与避孕杂志 2022年第10期42卷 1003-1007页

作者：董建军赵晶鹏杨超姚晨成田汝辉智二磊张建雄李铮李朋上海交通大学医学院附属第一人民医院泌尿外科临床医学中心男科男性健康评估中心上海200080 焦作市妇女儿童医院男科焦作454000 南京医科大学生殖医学国家重点实验室南京211166 江苏省人民医院泌尿外科南京210029

目的旨在探讨梗阻性无精子症(obstructive azoospermia,OA)患者卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)助孕失败后精道显微重建可行性和安全性。方法回顾性分析2015年9月至2020年5月期间于上海交通大学医学院附属... 详细信息

目的旨在探讨梗阻性无精子症(obstructive azoospermia,OA)患者卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)助孕失败后精道显微重建可行性和安全性。方法回顾性分析2015年9月至2020年5月期间于上海交通大学医学院附属第一人民医院泌尿外科临床医学中心男科收治的20例既往ICSI助孕失败的OA患者资料,总结精道显微重建术特点,并计算其术后复通率与临床妊娠率。结果显微镜下精道重建术中,8例患者存在输精管梗阻,12例患者存在附睾梗阻。输精管梗阻患者中,1例为外伤性OA,行腹腔镜辅助的右侧输精管吻合术(vasovasostomy,VV);7例为幼年斜疝术后OA,其中6例进一步行腹腔镜辅助的VV,1例行输精管附睾交叉吻合术;8例患者中6例术后复通,2例术后女方自然妊娠。附睾梗阻患者均行显微镜下输精管附睾吻合术(vasoepididymostomy,VE),12例患者中6例术后复通,3例术后女方自然妊娠。所有患者术中、术后均未出现明显并发症。结论输精管道显微重建手术是OA患者ICSI助孕失败后的一种有效的补救措施,可帮助患者实现自然妊娠。

关键词：不育,男性精子注射,细胞质内梗阻性无精子症显微精道重建术

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单细胞转录组测序技术在人精原干细胞研究中的应用

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南京医科大学学报（自然科学版） 2023年第5期43卷 732-737页

作者：刘士玮罗嘉强朱子珏赵亮宇姚晨成田汝辉李铮南京医科大学附属上海一院临床医学院上海201066 上海交通大学医学院附属第一人民医院泌尿外科中心男科/上海交通大学泌尿外科研究所男性健康评估中心上海200080

精原干细胞的自我更新、增殖与分化对于维持精子发生至关重要。然而,调控这一过程的分子机制尚未完全阐明。精原干细胞具有不同细胞亚型,其在精子发生过程中扮演不同角色。单细胞转录组测序技术提供有效的手段,揭示各精原细胞亚型及其... 详细信息

精原干细胞的自我更新、增殖与分化对于维持精子发生至关重要。然而,调控这一过程的分子机制尚未完全阐明。精原干细胞具有不同细胞亚型,其在精子发生过程中扮演不同角色。单细胞转录组测序技术提供有效的手段,揭示各精原细胞亚型及其转录组水平和生物学功能变化,为精原干细胞的分子机制研究提供新思路。

关键词：精子发生单细胞转录组测序精原干细胞

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基于单细胞RNA测序解析人与小鼠睾丸中SARS-CoV-2相关受体的时空表达特征

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上海交通大学学报（医学版） 2021年第4期41卷 421-426页

作者：罗嘉强赵亮宇姚晨成朱子珏邢晓宇李朋田汝辉陈慧兴孙杰李铮上海交通大学附属第一人民医院泌尿外科中心男科辅助生殖医学科上海200080 上海交通大学泌尿外科研究所男性健康评估中心上海市生殖医学重点实验室上海200080 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心泌尿外科上海200127

目的·基于单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-Seq),分析严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)受体血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)在人和小鼠睾丸中的时空表达特征。方法·收集生理性各发育阶段的人睾丸组织10例和C57BL/6小鼠睾丸组织9例,用酶消化成单细胞悬液后经scRNA-Seq标准处理程序得到细胞-基因表达矩阵。经过质量控制、数据标准化、批次效应处理和聚类降维后,利用已知的睾丸细胞标志物注释各群细胞,以明确在发育的不同阶段中人和小鼠睾丸中ACE2表达模式和差异。结果·鉴定出人和小鼠均有的睾丸细胞亚群9个,包括3群生殖细胞(精原细胞、精母细胞和精子细胞/精子)和6群体细胞(Sertoli细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、Leydig细胞和管周肌样细胞)。从空间分布来看,在成人睾丸中,ACE2主要表达于Sertoli细胞,在Leydig细胞、管周肌样细胞和生殖细胞也有表达。从时间尺度上看,人Sertoli细胞的ACE2转录丰度随着睾丸的发育而增加,青春期后Sertoli细胞中ACE2表达显著高于幼儿期和儿童期(P=0.000)。从小鼠睾丸发育各阶段来看,Ace2表达模式与人体均有显著不同。在5周龄成年C57BL/6小鼠睾丸中,Ace2的转录水平低且主要表达于血管平滑肌细胞(P=0.000),而Sertoli细胞中Ace2阳性细胞数则极少。结论·SARS-CoV-2可能主要通过Sertoli细胞感染人类睾丸,常规C57BL/6小鼠模型不适用于模拟SARS-CoV-2感染对人类睾丸的功能影响。

关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒2 单细胞RNA测序血管紧张素转化酶2 病毒性睾丸炎 sertoli细胞

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精索静脉曲张与精索脉管解剖的相关性

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中华医学杂志 2017年第16期97卷 1244-1247页

作者：赵亮宇田汝辉黄煜华陈慧兴李朋万众姚晨成杨超智二磊李铮上海交通大学附属第一人民医院泌尿外科中心男科/盆底尿失禁外科上海交通大学泌尿外科研究所男性健康评估中心上海市生殖医学重点实验室 200080

目的探讨精索静脉曲张患者的精索脉管数目与静脉曲张相关指标的关系，为精索静脉曲张的术前评估和手术治疗提供参考。方法选取2015年5月至2016年7月于上海市第一人民医院接受显微镜下左侧精索静脉结扎术的156例精索静脉曲张患者进行回... 详细信息

目的探讨精索静脉曲张患者的精索脉管数目与静脉曲张相关指标的关系，为精索静脉曲张的术前评估和手术治疗提供参考。方法选取2015年5月至2016年7月于上海市第一人民医院接受显微镜下左侧精索静脉结扎术的156例精索静脉曲张患者进行回顾性分析，记录静脉曲张程度和术中发现的左侧精索脉管数目，按照患者精索内动脉（ISA）数目把患者分为单根动脉组（55例）、双根动脉组（63例）和多根动脉组（38例），探讨各精索脉管数目之间的相关性，比较各组患者精索静脉曲张程度、睾丸体积、术前精液参数、术前性激素水平以及手术时间和住院天数等有无差异。结果精索静脉曲张患者ISA数目与精索内静脉数目（ISV）（r＝0.210；P＝0.008）和淋巴管数目（r＝0.224；P＝0.005）呈正相关；淋巴管数目与同侧引带静脉数目（r＝0.172；P＝0.032）和ISV数目（r＝0.296，P＝0.000）呈正相关。多根动脉组的ISV数目多于单根动脉组[（10.58±4.28）比（8.22±3.10）根，P＝0.003]，且其淋巴管数目[（4.11±1.90）根]多于双根动脉组[（3.76±1.40）根，P＝0.020]和单根动脉组[（3.13±1.52）根，P＝0.007]。另外，Ⅱ度精索静脉曲张患者的ISV数目多于Ⅲ度精索静脉曲张的患者[（9.74±3.90）比（8.33±3.10）根，P＝0.013]。单根动脉组、双根动脉组和多根动脉组3组患者的静脉曲张程度以及手术前后精液参数、性激素水平、睾丸体积、手术时间以及住院天数等指标差异无统计学意义。结论精索脉管之间存在数量相关性，特别是Ⅱ度精索静脉曲张并伴有多根ISA的患者往往具有更多的ISV和淋巴管，这类患者手术中在保护ISA的同时应更加注意尽可能将曲张的ISV结扎完全并保护淋巴管以防止复发和术后并发症。

关键词：精索静脉曲张显微外科手术精索内动脉精索内静脉淋巴管

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