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分子信标探针技术用于PCR检测诺卡氏菌SecA1基因

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中国人兽共患病学报 2017年第6期33卷 508-512页

作者：王颜颜夏茂宁明春艳黄劲刘涛华周兵康颖倩贵州医科大学微生物学教研室贵阳550025 贵州医科大学生化与分子生物学教研室贵阳550025

目的将诺卡氏菌属细菌的一段特异性DNA设计成分子信标探针,用于该细菌的PCR检测。方法将诺卡氏菌属细菌、戈登氏菌属细菌及红球菌属细菌菌株分别接种于脑心浸液琼脂培养基分离培养,观察其生长情况,提取菌株DNA作为扩增模板;设计诺卡氏... 详细信息

目的将诺卡氏菌属细菌的一段特异性DNA设计成分子信标探针,用于该细菌的PCR检测。方法将诺卡氏菌属细菌、戈登氏菌属细菌及红球菌属细菌菌株分别接种于脑心浸液琼脂培养基分离培养,观察其生长情况,提取菌株DNA作为扩增模板;设计诺卡氏菌属细菌基于secA1基因的特异性分子信标探针,在实时荧光定量PCR反应译体系中加入分子信标探针,PCR产物进行荧光信号检测。结果诺卡氏菌secA1基因经实时荧光定量PCR扩增后可产生阳性荧光信号,红球菌属细菌及戈登氏菌属细菌的secA1基因、阴性对照实验组及空白对照组经实时荧光定量PCR扩增后不产生荧光信号,为阴性。结论 secA1作为看家基因,是用来进行种水平的鉴定及系统进化研究非常理想的靶分子,而分子信标探针技术可以准确、快速、灵敏的进行诺卡氏菌secA1基因检测。

关键词：诺卡氏菌属 SecA1基因分子信标探针实时荧光定量PCR

几类主要病原需氧放线菌菌属的SecA1基因分析研究

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中国人兽共患病学报 2016年第4期32卷 349-355页

作者：牟丽丽涂云华明春艳夏茂宁孟俞辰康颖倩贵州医科大学微生物学教研室贵阳550004 贵州医科大学附属医院皮肤性病专科贵州550004

目的了解几类主要病原需氧放线菌不同菌属间SecA1基因碱基突变特点,为病原需氧放线菌的实验室诊断,分类及致病性提供一定的实验室理论数据。方法以162株需氧放线菌为实验研究对象,通过分子生物学方法对需氧放线菌SecA1基因扩增测序,及收... 详细信息

目的了解几类主要病原需氧放线菌不同菌属间SecA1基因碱基突变特点,为病原需氧放线菌的实验室诊断,分类及致病性提供一定的实验室理论数据。方法以162株需氧放线菌为实验研究对象,通过分子生物学方法对需氧放线菌SecA1基因扩增测序,及收集NCBI数据库中已发表的需氧放线菌SecA1基因,运用多序列对比及DNAStar软件对需氧放线菌SecA1序列进行特异性基序分析及SecA1蛋白的二级结构和表位特性预测。结果需氧放线菌不同菌属间SecA1序列在300～350bp区域有着特异性差异,经预测该区域编码的SecA1蛋白二级结构属间大致相同,而蛋白质柔性区域、亲水性及表面可及性等性质在属间存在差异,其中以Mycobacteria菌属的差异较为明显。结论需氧放线菌SecA1基因不同菌属间具有特异性的碱基突变,这种突变导致属间SecA1蛋白部分性质有差异,与各菌属致病性可能存在着一定的相关性。

关键词：需氧放线菌 SecA1基因碱基突变 SecA1蛋白

不同来源白念珠菌感染小鼠前后胞外水解酶活力差异

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中国人兽共患病学报 2018年第7期34卷 613-618,634页

作者：夏茂宁邱文牛雪可王梅竹赵亮张金娟田敏廖万清康颖倩贵州医科大学微生物学教研室贵阳550025 贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室暨环境污染与疾病监控省部共建教育部重点实验室贵阳550025 贵州医科大学机能实验室贵阳550025 海军军医大学附属长征医院皮肤科上海200003

目的了解白念珠菌进入小鼠宿主前后其分泌胞外水解酶能力是否改变。方法挑选分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶、脂肪酶活力无差异的艾滋病、外阴阴道念珠病病患来源和健康人来源白念珠菌,尾静脉注射感染小鼠,分离发病死亡小鼠肾脏菌株,比... 详细信息

目的了解白念珠菌进入小鼠宿主前后其分泌胞外水解酶能力是否改变。方法挑选分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶、脂肪酶活力无差异的艾滋病、外阴阴道念珠病病患来源和健康人来源白念珠菌,尾静脉注射感染小鼠,分离发病死亡小鼠肾脏菌株,比较感染小鼠前后菌株胞外水解酶活力差异。结果不同来源菌株感染的小鼠28d内死亡速率差异显著(χ2=82.5,P0.05);各来源白念珠菌感染小鼠前后均未测得脂肪酶活力。结论在宿主体内白念珠菌表达天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶能力相较于体外有增强;在不同宿主环境状态下,白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶和磷脂酶的潜在表达能力有差异,即宿主免疫状态越弱时,白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶潜在表达能力越强。

关键词：白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶磷脂酶脂肪酶小鼠模型

16SrRNA和secA1基因构建临床诺卡菌的系统发育树比较

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贵州医科大学学报 2017年第4期42卷 409-415页

作者：王颜颜夏茂宁欧维正黄劲明春艳刘涛华吕倩周兵康颖倩贵州医科大学微生物学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学贵阳市公共卫生救治中心贵州贵阳550003 贵州医科大学生化与分子生物学教研室贵州贵阳550025

目的:比较16S rRNA和secA1基因构建诺卡菌分属Nocardia wallacei、Nocardia farcinica、Nocardia cyriacigeorgica及Nocardia otitidiscaviarum4个种系统发育树的多样性。方法:将8株临床分离的诺卡菌菌株分别接种于脑心浸出液琼脂培养基分离培养,观察其生长情况;提取细菌DNA,采用聚合酶链式反应扩增其16S rRNA和secA1基因序列并测序,所获序列与NCBI数据库进行BLAST比对,鉴定其菌种名;选取本研究鉴定的4个属共有的40个有效发表种及本研究分离的8株诺卡菌菌株的种,通过邻接法、最大似然法分别构建16S rRNA和secA1基因序列的系统发育树并比较。结果:本研究所收集的诺卡菌分属Nocardia wallacei、Nocardia farcinica、Nocardia cyriacigeorgica及Nocardia otitidiscaviarum 4个种,且Nocardia wallacei、Nocardia farcinica及Nocardia cyriacigeorgica基于secA1基因构建的系统发育树较16S rRNA在种内菌株亲缘关系的分化差异程度高及分类多样性多(P0.05)。结论:secA1基因用于诺卡菌种群的系统发育分析和分子进化的研究,较16S rRNA具有高度分辨率的优势。

关键词：基因,结构,细菌放线菌属发育生物学诺卡菌 16S rRNA基因 sec A1基因聚合酶链反应

三种不同来源白念珠菌感染对小鼠的致病性研究

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贵州医科大学学报 2018年第4期43卷 373-377,388页

作者：夏茂宁牛雪可邱文黄劲王梅竹赵亮廖万清康颖倩贵州医科大学微生物学教研室贵州贵阳550025 贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室暨环境污染与疾病监控省部共建教育部重点实验室贵州贵阳550025 贵州医科大学生物化学与分子生物学教研室贵州贵阳550025 海军军医大学附属长征医院皮肤科上海200003

目的:探讨3种不同来源白念珠菌对小鼠致病性的差异。方法:选取获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、外阴阴道念珠菌病(VVC)患者来源和健康人来源白念珠菌尾静脉注射感染小鼠,同时设立生理盐水尾静脉注射小鼠作为对照组;分别于7~11 d、14~18 d及... 详细信息

目的:探讨3种不同来源白念珠菌对小鼠致病性的差异。方法:选取获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、外阴阴道念珠菌病(VVC)患者来源和健康人来源白念珠菌尾静脉注射感染小鼠,同时设立生理盐水尾静脉注射小鼠作为对照组;分别于7~11 d、14~18 d及21~25 d 3个时期段,观察各组小鼠的死亡数及死亡率;无菌分离肾脏靶器官,观察各组小鼠的肾指数及肾脏负荷;收集从肾脏分离得到的白念珠菌,比较3种不同来源白念珠菌株菌丝形成能力。结果:3种不同来源菌株感染的小鼠28 d内死亡率、小鼠肾指数及其肾脏分离菌株菌丝形成能力差异有统计学意义(P0.05)。结论:菌株来源与其致病性强弱有关,菌株的菌丝形成能力是更为重要的致病因素。

关键词：白念珠菌小鼠模型,动物肾指数肾脏负荷菌丝形成

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贵阳市某医院非结核分枝杆菌流行状况分析

贵州医科大学学报 2017年第3期42卷 322-326页

作者：王颜颜欧维正夏茂宁黄劲秦万蒙俊王明栋明春艳康颖倩贵州医科大学微生物学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学贵阳市公共卫生救治中心贵州贵阳550003 贵州医科大学生化与分子生物学教研室贵州贵阳550025

目的:了解2012-2013年贵阳市非结核分枝杆菌(NTM)的流行情况。方法:对贵阳市某医院2012-2013年就诊的可疑结核病患者进行分枝杆菌的培养鉴定,采用PCR-荧光探针及基因芯片法进行鉴定,并对相关结果进行分析。结果:1 500例患者经分离培养和... 详细信息

目的:了解2012-2013年贵阳市非结核分枝杆菌(NTM)的流行情况。方法:对贵阳市某医院2012-2013年就诊的可疑结核病患者进行分枝杆菌的培养鉴定,采用PCR-荧光探针及基因芯片法进行鉴定,并对相关结果进行分析。结果:1 500例患者经分离培养和PCR-荧光探针及基因芯片法鉴定为结核分枝杆菌感染的1 469例,鉴定为NTM感染的31例,占2.06%,其中8株为鸟分枝杆菌,10株为胞内分枝杆菌,9株为龟或脓肿分枝杆菌,偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌及蟾蜍分枝杆菌各1株,分别占NTM 25.80%、32.25%、29.03%、3.23%、3.23%、3.23%、3.23%;NTM感染的阳性患者中,男女比例为1.21∶1,30~59岁年龄段占61.29%;不同性别的感染高峰年龄段不同,男性以75~89岁、女性则以45~59岁年龄段。结论:贵阳市存在一定比例的NTM菌感染,以鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌为主。

关键词：分枝杆菌,结核分枝杆菌,鸟分枝杆菌,非结核菌种鉴定基因芯片

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几株真菌对白酒丢糟纤维素水解能力的研究

贵州医科大学学报 2017年第11期42卷 1274-1278页

作者：明春艳王颜颜曹煜邱婷婷夏茂宁牛雪可邱文万会燕康颖倩贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室暨环境污染与疾病监控省部共建教育部重点实验室贵州贵阳550025 贵州医科大学微生物学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学贵州医科大学附院皮肤性病科贵州贵阳550004

目的:筛选对丢糟中纤维素水解能力强的真菌菌株。方法:选择7株具有水解纤维素酶的真菌,以羧甲基纤维素钠(CMCNa)为唯一碳源的培养基进行初筛、以丢糟为唯一营养物质的酸性固体或液体培养基培养,观察培养24 h时培养基上水解圈及真菌直径... 详细信息

目的:筛选对丢糟中纤维素水解能力强的真菌菌株。方法:选择7株具有水解纤维素酶的真菌,以羧甲基纤维素钠(CMCNa)为唯一碳源的培养基进行初筛、以丢糟为唯一营养物质的酸性固体或液体培养基培养,观察培养24 h时培养基上水解圈及真菌直径,测定液体培养基中丢糟的减重率及纤维素的水解率,筛选高效水解丢糟中纤维素的真菌。结果:从7株真菌中筛选出G-7 Trichoderma reese,G-1 Phanerochaete chrysosporium,G-2 Trichoderma longibrachiatum,G-3 Trichoderma longibrachiatum 4株高效水解丢糟中纤维素的真菌,在CMCNa-刚果红培养基上培养6 d的水解圈直径D/菌饼直径d(D/d))为6.0∶7.5、1.7∶2.7、5.2∶7.5、5.0∶7.5;在丢糟酸性固体培养基上G-7、G-1、G-2、G-3生长良好,对丢糟的降解能力依次是65.73%、61.90%、61.22%、59.62%,对丢糟中纤维素的水解大小依次是57.62%、54.22%、49.41%、44.21%。结论:G-1、G-2、G-3、G-7为高效水解菌株;利用CMCNa-刚果红培养基判断菌株对纤维素的水解能力具有一定的参考价值;利用丝状真菌处理丢糟,有利于丢糟的转化利用。

关键词：真菌丢糟纤维素酶水解培养基酒糟

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猪圈发酵床中细菌的分离鉴定及其特征研究

贵州医科大学学报 2018年第4期43卷 383-388页

作者：孟俞辰牛雪可邱文王颜颜兰咏哲张笑娟明春艳夏茂宁廖万清康颖倩贵州医科大学微生物学教研室贵州贵阳550025 贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室暨环境污染与疾病监控首都共建教育部重点实验室贵州贵阳550025 海军军医大学附属长征医院皮肤科上海200003

目的:研究猪圈发酵床分离细菌的系统发育树及生理生化特征。方法:采用R2A培养基对猪发酵床上层垫料进行分离菌株培养,将培养得到的单个菌落培养于固体培养基中,获得纯培养菌株;肉眼观察培养基中细菌的生长情况,电镜下观察细菌的形态、... 详细信息

目的:研究猪圈发酵床分离细菌的系统发育树及生理生化特征。方法:采用R2A培养基对猪发酵床上层垫料进行分离菌株培养,将培养得到的单个菌落培养于固体培养基中,获得纯培养菌株;肉眼观察培养基中细菌的生长情况,电镜下观察细菌的形态、大小和排列特点,采用16S rRNA基因序列扩增、测序,邻接法构建16S rRNA序列的系统发育树,将分离到的猪圈发酵床中的细菌与文献中获知的初期发酵床优势细菌的标准菌株进行生理生化特征的比对。结果:在R2A培养基中分离得到3株细菌SZDIS-1-1、GZDIS-1和SZDIS-2,鉴定为微杆菌属细菌;与文献中获知的4种标准菌株一样,培养得到的3种细菌镜下均为杆状,过氧化氢酶、吲哚试验均为阴性,能够利用麦芽糖作为生长碳源;药敏试验显示,分离得到的3株细菌对阿米卡星、头孢呋辛、利福平、妥布霉素、青霉素和环丙沙星等抗生素比较敏感,其中头孢呋辛抑菌效果最佳。结论:在猪圈发酵床首次分离得到3株菌株,并构建系统发育树。

关键词：细菌抗生素敏感系统发育树 16S rRNA基因微生物多样性猪圈发酵床

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中国东海海水中弧菌的分离鉴定及耐药性分析

贵州医科大学学报 2018年第4期43卷 378-382,388页

目的:对中国东海海水进行细菌分离,为东海海水中微生物的鉴定及抗生素的合理使用提供理论依据。方法:对取自中国东海海岸线(约北纬30°、东经118°)水域海水样品进行分离纯化,扩增分离菌株,将分离得到的菌株采用Chelex法提取DNA,并进行1... 详细信息

目的:对中国东海海水进行细菌分离,为东海海水中微生物的鉴定及抗生素的合理使用提供理论依据。方法:对取自中国东海海岸线(约北纬30°、东经118°)水域海水样品进行分离纯化,扩增分离菌株,将分离得到的菌株采用Chelex法提取DNA,并进行16S rRNA基因序列测序,邻接法构建16S rRNA序列的系统发育树,确认分离得到弧菌菌株的分类地位,同时分离的弧菌属菌株和弧菌属常见致病菌株进行耐药性比对分析。结果:从中国东海海岸线水域的海水样品中分离得到2株弧菌属菌株DH-1和DH-2,分子学分析鉴定DH-1为Vibrio marisflavi,DH-2为Vibrio hangzhouensis;经抗生素试验比对,海水分离的弧菌属菌株与副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌等常见的临床致病菌株对某些抗生素具有相同程度的耐药性。结论:分离的弧菌菌株具有较强的耐药性。

关键词：弧菌耐药性抗生素系统发育树 16S rRNA基因东海海水