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作者：唐南洪福建医科大学

学位级别：硕士

原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,病死率高,复发转移是影响预后的最主要因素。肝癌细胞的侵袭转移能力与其产生降解细胞外基质(ECM)的蛋白水解酶能力密切相关。目前针对ECM相关蛋白酶的生物治疗已经成为肝癌治疗研究的热点,其... 详细信息

原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,病死率高,复发转移是影响预后的最主要因素。肝癌细胞的侵袭转移能力与其产生降解细胞外基质(ECM)的蛋白水解酶能力密切相关。目前针对ECM相关蛋白酶的生物治疗已经成为肝癌治疗研究的热点,其中蛇毒活性成分的药用价值更是不断得到认可。我们前期克隆了蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-Cystatin)和蛇毒金属蛋白酶抑制剂(BJ46a)基因,初步证明其各自具有抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的侵袭转移功能。鉴于sv-Cystatin和BJ46a抑制肿瘤侵袭转移作用的靶点不同,我们设想二者联合表达存在协同作用的可能。为此,我们应用双基因真核表达载体将sv-Cystatin和BJ46a同时导入人的高转移肝癌细胞株MHCC97H,通过体外和动物在体实验研究各自的抗肝癌侵袭转移作用、协同作用和存在的新功能,探讨两种基因的表达对肝癌细胞影响的可能分子机制,并利用重组sv-Cystatin与BJ46a腺病毒观察体内应用的初步治疗效果。一、表达sv-Cystatin或/和BJ46a基因的MHCC97H细胞株的建立利用分子克隆技术构建了重组表真核达载体pBudCE4.1/sv-Cystatin、pBudCE4.1/BJ46a和pBudCE4.1/sv-Cystatin+Bj46a;经Western Blot证实建立的细胞株MHCC97H/sv-Cystatin、MHCC97H/BJ46a和MHCC97H/sv-Cystatin+Bj46a可以分别稳定表达sv-Cystatin、BJ46a和同时表达sv-Cystatin和BJ46a,为后续研究提供了实验材料。二、sv-Cystatin或/和BJ46a表达对MHCC97H细胞生长、侵袭转移功能的影响体外细胞活力和裸鼠皮下肝癌细胞原位瘤重分析表明,表达sv-Cystatin能显著地抑制MHCC97H细胞的体外、体内增殖能力,但sv-Cystatin和BJ46a共同表达时没有协同作用。细胞培养中发现表达sv-Cystatin可以使MHCC97H细胞具有聚集成团倾向,细胞间连接更为紧密,并具有抑制MHCC97H细胞体外趋化的作用。利用Transwell--Matrigel实验和裸鼠皮下肝癌细胞肺转移模型证实表达sv-Cystatin和BJ46a具有各自抑制MHCC97H细胞体外、体内侵袭转移的作用,共表达时具有协同作用。三、sv-Cystatin或/和BJ46a表达对MHCC97H细胞生长、侵袭转移影响的分子机制流式细胞检测、电镜观察和TUNEL实验证实诱导凋亡是表达sv-Cystatin的MHCC97H细胞生长增殖能力降低的原因,其可能的机制为sv-Cystatin的表达下调Twist表达,降低Twist所介导的抑制P53分子通路的保护细胞作用,直接导致促凋亡作用的P53表达升高及其靶分子Bax的上调,启动凋亡线粒体通路级联反应。BJ46a不具有此功能,故sv-Cystatin和BJ46a共表达时没有体现诱导凋亡的协同作用。细胞培养上清通过荧光分光光度检测Cathepsin B、明胶酶谱分析MMPs,培养细胞通过凝胶迁移分析转录因子Twist活性及其相关的E-cadherin和N-cadherin表达等证明:(1)MMP2和MMP9的活性的下降是表达BJ46a的MHCC97H细胞侵袭能力减弱的直接原因;(2)CathepsinB、MMP2和MMP9活性的同时下降,Twist活性减弱导致的E-cadherin表达上调和N-cadherin表达下调共同促成了表达sv-Cystatin的MHCC97H细胞侵袭能力的抑制;(3)以上二者因素的协同作用导致同时表达sv-Cystatin和BJ46a的MHCC97H细胞的侵袭能力最弱。四、重组sv-Cystatin和BJ46a腺病毒治疗转移性肝癌的实验研究利用腺病毒载体pShuttle-IRES-hrGFP-1构建了携带sv-Cystatin和BJ46a基因的重组腺病毒。通过裸鼠皮下肝癌细胞肺转移模型的瘤内注射治疗实验证实Ad/sv-Cystatin可以降低MHCC97H细胞的肺转移率30.4%,而联合注射Ad/sv-Cystatin和Ad/BJ46a可降低28%,未见协同作用;瘤内注射Ad/sv-Cystatin在一定程度上具有抑制MHCC97H细胞生长的作用。

关键词：蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-Cystatin) 蛇毒金属蛋白酶抑制剂(BJ46a) 肝癌侵袭转移细胞生长凋亡

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一个急性髓系白血病家系成员的染色体脆性部位观察

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中华医学遗传学杂志 1993年第6期10卷 359-360页

作者：何立珍唐南洪吕联煌福建省血液病研究所

染色体脆性部位(fra)与恶性肿瘤之间的关系一直是个有争议的问题,不少资料表明恶性疾病患者外周血淋巴细胞脆性部位表达率增高,而且与肿瘤细胞的非随机性染色体断裂点(NCB)、癌基因位点(ONC)有一致性;但Sutherland等却认为普通型fra和... 详细信息

染色体脆性部位(fra)与恶性肿瘤之间的关系一直是个有争议的问题,不少资料表明恶性疾病患者外周血淋巴细胞脆性部位表达率增高,而且与肿瘤细胞的非随机性染色体断裂点(NCB)、癌基因位点(ONC)有一致性;但Sutherland等却认为普通型fra和癌断点之间不存在相关性,我们选择一个16年间7例急性髓系白血病发病并死亡的家系作为观察对象,检测他们的脆性部位携带情况,探讨脆性部位与急性白血病发病的关系。

关键词：脆性部位一级亲属急性髓系白血病家系成员非血缘

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t（8;21）伴习惯性流产一例

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中华医学遗传学杂志 1994年第2期11卷 77-77页

作者：唐南洪王广芬福建医学院附属协和医院遗传室

ｔ（８；２１）伴习惯性流产一例唐南洪，王广芬患者男，３１岁，汉族。表型正常，体健。非近亲婚配，婚后两年其妻连续流产两次，均发生在妊娠２个多月时，无明显诱因，保胎无效。女方妇科检查无异常。患者父亲患肌肉萎缩８年，不能行... 详细信息

ｔ（８；２１）伴习惯性流产一例唐南洪，王广芬患者男，３１岁，汉族。表型正常，体健。非近亲婚配，婚后两年其妻连续流产两次，均发生在妊娠２个多月时，无明显诱因，保胎无效。女方妇科检查无异常。患者父亲患肌肉萎缩８年，不能行走。患者兄妹５人，其弟妻子流产２次...

关键词：习惯性流产唐南洪滑胎近亲婚配肌肉萎缩肌萎缩王广

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丝裂霉素C对生殖状况不良夫妇SCE的影响初步研究

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中华医学遗传学杂志 1995年第2期12卷 115-116页

作者：唐南洪王广芬徐文宏福建医学院附属协和医院遗传室

丝裂霉素Ｃ对生殖状况不良夫妇ＳＣＥ的影响初步研究唐南洪，王广芬，徐文宏姐妹染色单体交换（ＳＣＥ）作为测定染色体不稳定的指标，已应用于生殖毒理学和诱变性测定的研究［１］。ＳＣＥ技术检测染色体损伤要比染色体断裂敏感１００... 详细信息

丝裂霉素Ｃ对生殖状况不良夫妇ＳＣＥ的影响初步研究唐南洪，王广芬，徐文宏姐妹染色单体交换（ＳＣＥ）作为测定染色体不稳定的指标，已应用于生殖毒理学和诱变性测定的研究［１］。ＳＣＥ技术检测染色体损伤要比染色体断裂敏感１００倍以上，而用极低量的诱变剂丝裂霉素...

关键词： SCE 染色体畸变丝裂霉素C DNA 药物副作用

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318例精液HBsAg的测定及结果分析

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男性学杂志 1995年第2期9卷 103-104页

作者：徐两蒲唐南洪福建省妇幼保健院福建医学院附属协和医院

３１８例精液ＨＢｓＡｇ的测定及结果分析福建省妇幼保健院（３５０００１）徐两蒲福建医学院附属协和医院唐南洪精液中ＨＢｓＡｇ测定文献报道很少。本文收集不育男性精液３１８份进行ＨＢｓＡｇ测定，同时与血清ＨＢｓＡｇ测定进行了... 详细信息

３１８例精液ＨＢｓＡｇ的测定及结果分析福建省妇幼保健院（３５０００１）徐两蒲福建医学院附属协和医院唐南洪精液中ＨＢｓＡｇ测定文献报道很少。本文收集不育男性精液３１８份进行ＨＢｓＡｇ测定，同时与血清ＨＢｓＡｇ测定进行了比较。材料和方法１．标本来源收集男...

关键词：精液乙型肝炎表面抗原测定

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构建特异高表达人谷氨酰胺合成酶基因的肝细胞

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中华实验外科杂志 2007年第7期24卷 817-819页

作者：王晓茜唐南洪李秀金陈燕凌福建医科大学附属协和医院省肝胆外科研究所福州350001

目的建立高表达人谷氨酰胺合成酶(hGS)基因的人肝细胞系。方法克隆hGS基因及人甲胎蛋白转录调控元件(AFP TREs),构建真核表达载体pLNChGS及插入人AFP TREs的载体pLNAFhGS;经包装产生重组逆转录病毒并感染HepG2细胞,得到阳性细胞克隆HepG... 详细信息

目的建立高表达人谷氨酰胺合成酶(hGS)基因的人肝细胞系。方法克隆hGS基因及人甲胎蛋白转录调控元件(AFP TREs),构建真核表达载体pLNChGS及插入人AFP TREs的载体pLNAFhGS;经包装产生重组逆转录病毒并感染HepG2细胞,得到阳性细胞克隆HepG2/ pLNChGS和HepG2/pLNAFhGS;进行细胞增殖、hGS mRNA半定量及酶活性检测。结果HepG2/ pLNChGS、HepG2/pLNAFhGS细胞的hGS mRNA表达分别为8.306±0.336和21.358±1.716,均显著高于对照细胞(P<0.01),且两者之间比较差异有统计学意义(P<0.01);HepG2/pLNChGS、HepG2/pLNAFhGS细胞的hGS酶活性分别为3.279±0.328和4.557±0.253,均显著高于对照细胞(P<0.05),两者之间比较差异也有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建高分泌hGS的人肝细胞系,为进一步降氨毒功能的研究打下基础。

关键词：肝细胞谷氨酰胺合成酶氨

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HBx通过上调前列腺素E_2受体2的表达增强HL-7702肝细胞的侵袭能力

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中国肿瘤临床 2011年第24期38卷 1529-1534页

作者：陈文豪王晓茜李秀金唐南洪福州市鼓楼医院检验科福州市350001 福建医科大学附属协和医院省肝胆外科研究所

目的:以HL-7702肝细胞为研究对象,探讨HBx的表达对EPs的影响以及与侵袭转移的相关性。方法:建立表达HBx的HL-7702人正常肝细胞(HL-7702/HBx),采用HBxRNAi载体构建抑制HBx的HL-7702肝细胞株(HL-7702/HBx-siRNA),检测抑制HBx前后细胞培养... 详细信息

目的:以HL-7702肝细胞为研究对象,探讨HBx的表达对EPs的影响以及与侵袭转移的相关性。方法:建立表达HBx的HL-7702人正常肝细胞(HL-7702/HBx),采用HBxRNAi载体构建抑制HBx的HL-7702肝细胞株(HL-7702/HBx-siRNA),检测抑制HBx前后细胞培养上清PGE_2浓度的变化、细胞表达EPs mRNA和基质金属蛋白酶(MMPs)mRNA的变化,并进一步采用EP2-siRNA瞬时转染、Western-blot、明胶酶谱和Transwell小室等技术观察EP2表达的抑制对MMPs活性以及细胞侵袭和转移能力的影响。结果:与对照细胞相比,PGE_2、EP2和MMP-2的mRNA相对表达值在HL-7702/HBx细胞明显增高(P<0.05),分别为(123.9+9.9)Pg·mL^(-1)、(0.445+0.025)Pg·mL^(-1)和(0.226+0.016)Pg·mL^(-1),在抑制HBx表达后则明显下调(P<0.05),分别为(78.0±5.9)Pg·mL^(-1)、(0.336+0.007)Pg·mL^(-1)和(0.117+0.012)pg·mL^(-1);对照细胞HL-7702的EP2表达抑制前后,MMP2活性、细胞侵袭和移动能力变化不明显;而HL-7702/HBx细胞的EP2表达受抑制后,其MMP2活性和细胞侵袭能力则明显下降(P<0.05),侵袭细胞数由(64.4+3.4)个/视野下降为(55.2+2.2)个/视野,细胞的移动能力变化不大。结论:HBx可以促进EP2表达和增加MMP2活性,并通过EP2上调HL-7702肝细胞的侵袭能力。抑制EP2表达可能对HBV感染的肝癌侵袭转移治疗研究具有潜在的应用价值。

关键词：肝细胞乙肝病毒X蛋白前列腺素E2受体侵袭

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蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组腺病毒对人肝癌细胞 MHCC97H 侵袭转移的影响

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第二军医大学学报 2014年第6期35卷 668-671页

作者：谢群唐南洪林扬元林建银福建省莆田学院基础医学院莆田351100 福建医科大学分子医学研究中心消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福州350004 福建医科大学附属协和医院省肝胆外科研究所福州350001

目的构建携带蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)基因的重组腺病毒载体(Ad/sv-cystatin),研究其对人肝癌细胞MHCC97H在体内、外侵袭转移的影响。方法构建携带sv-cystatin的重组腺病毒,体外感染MHCC97H细胞,采用CCK-8法检测细胞生长,... 详细信息

目的构建携带蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)基因的重组腺病毒载体(Ad/sv-cystatin),研究其对人肝癌细胞MHCC97H在体内、外侵袭转移的影响。方法构建携带sv-cystatin的重组腺病毒,体外感染MHCC97H细胞,采用CCK-8法检测细胞生长,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力,通过裸鼠皮下肝癌细胞肺转移模型观察Ad/sv-cystatin瘤内注射对裸鼠的治疗作用。结果体外实验证实Ad/sv-cystatin能够感染MHCC97H细胞。与对照组及空载体组相比,Ad/sv-cystatin对MHCC97H细胞体外生长、侵袭和迁移均具有明显的抑制作用,瘤内注射Ad/sv-cystatin可以显著降低MHCC97H细胞的肺转移。结论重组腺病毒Ad/sv-cystatin具有抑制人肝癌细胞MHCC97H体内外侵袭转移的作用,在肝癌基因治疗方面具有开发应用潜能。

关键词：蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂腺病毒肝细胞癌肿瘤侵袭肿瘤转移

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胆囊癌组织中血管内皮生长因子C和D的表达及其与淋巴管和血管生成的关系

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中华肿瘤杂志 2010年第3期32卷 190-195页

作者：蒋雷陈燕凌余菲菲唐南洪李秀金王晓茜福建医科大学附属协和医院肝胆外科福州350001 福建医科大学分子医学研究中心福建省高校感染与肿瘤重点实验室

目的探讨胆囊癌组织中血管内皮生长因子C（VEGF—C）和VEGF．D的表达及其与淋巴管和血管生成的关系。方法采用免疫组化法检测50例胆囊癌组织中VEGF—C、VEGF—D、D2-40和CD31的表达，以10例癌旁正常胆囊组织和19例慢性胆囊炎作为对照，... 详细信息

目的探讨胆囊癌组织中血管内皮生长因子C（VEGF—C）和VEGF．D的表达及其与淋巴管和血管生成的关系。方法采用免疫组化法检测50例胆囊癌组织中VEGF—C、VEGF—D、D2-40和CD31的表达，以10例癌旁正常胆囊组织和19例慢性胆囊炎作为对照，并分析其与临床病理诸因素的关系。结果50例胆囊癌组织中，32例VEGF—C表达阳性，阳性率为64．0％，31例VEGF．D表达阳性，阳性率为62．0％，均高于癌旁正常组织（P〈0．05），但与慢性胆囊炎差异无统计学意义（P〉0．05）。VEGF—C的表达与胆囊癌患者的年龄和淋巴结转移有关，VEGF—D的表达仅与胆囊癌患者的淋巴结转移有关。50例胆囊癌组织的微淋巴管密度（MLVD）和微血管密度（MVD）分别为6．9±3．6和36．1±12．8。VEGF—C阳性组和VEGF—D阳性组的MLVD和MVD均高于阴性组。MLVD与淋巴结转移有关，MVD与淋巴结转移、分化程度有关。VEGF—C与VEGF—D的表达呈正相关（r=0．498，P〈0．01）。结论在胆囊癌中，VEGF—C和VEGF-D参与胆囊癌的淋巴生成和血管生成的调节，通过增加瘤周淋巴管的密度促进肿瘤细胞的淋巴结转移。

关键词：胆囊肿瘤血管内皮生长因子C 血管内皮生长因子D 微淋巴管密度微血管密度淋巴结转移

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蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组蛋白对人肝癌MHCC97H细胞TGF-β2、TNF-α表达的影响

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中国药理学通报 2013年第9期29卷 1208-1212页

作者：谢群林扬元唐南洪林建银福建医科大学分子医学研究中心消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建福州350004 福建省莆田学院基础医学院福建莆田351100 福建医科大学附属协和医院省肝胆外科研究所福建福州350001

目的研究蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(snake venom cystatin,sv-cystatin)重组蛋白对人肝癌MHCC97H细胞转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响。方法采用ELISA方法检测不同浓度sv-cystatin重组蛋白对人肝癌MHCC97H细胞TGF-β2、TNF-α分泌的影响;实时定量PCR和Western blot法分别分析不同浓度sv-cystatin重组蛋白体外处理人肝癌MHCC97H细胞后TGF-β2、TNF-α的mRNA及蛋白表达。结果与对照组相比,5种浓度的sv-cystatin重组蛋白对MHCC97H细胞TGF-β2、TNF-α的分泌具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性(P<0.05);25、50、100、200 mg·L-14种浓度的重组蛋白能够抑制TGF-β2的mRNA及蛋白表达,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);而50、100、200 mg·L-13种浓度的重组蛋白能够抑制TNF-α的mRNA及蛋白表达,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 sv-cystatin重组蛋白可能通过抑制TGF-β2和TNF-α的表达来发挥多方面的抗肿瘤作用。

关键词：蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂肝癌 MHCC97H 转化生长因子β2 肿瘤坏死因子α

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