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CD59融合蛋白表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

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免疫学杂志 2000年第2期16卷 96-98页

作者：周镜然白云姜曼黎万玲第三军医大学免疫学教研室重庆400038

目的探索 GPI-锚固蛋白的体外表达 ,获得具有生物学活性的可溶性游离 CD5 9分子。方法通过 PCR选择性扩增编码成熟 CD5 9氨基酸序列的基因片段 ,并将之克隆入 Pin Point Xa- 3质粒中。 IPTG诱导融合蛋白表达 ,产物经亲和素树脂亲和层析... 详细信息

目的探索 GPI-锚固蛋白的体外表达 ,获得具有生物学活性的可溶性游离 CD5 9分子。方法通过 PCR选择性扩增编码成熟 CD5 9氨基酸序列的基因片段 ,并将之克隆入 Pin Point Xa- 3质粒中。 IPTG诱导融合蛋白表达 ,产物经亲和素树脂亲和层析。在体外微量反应性溶血抑制实验中检测重组 CD5 9纯化样品的生物学活性。结果筛选得到的重组子诱导后表达分子量约为 2 2 k D的生物素化 CD5 9融合蛋白。亲和素树脂纯化得到高纯度的蛋白样品。纯化分子在反应性溶血实验中表现出溶血抑制活性。结论本研究对体外表达无 GPI-锚的可溶性游离 CD5 9分子进行了表达探索 ,获得具一定生物学活性的游离重组 CD5 9,为进一步研制应用型 CD5 9活性分子打下基础。

关键词： CD59 融合蛋白大肠杆菌基因表达

抗人补体膜攻击复合物新抗原单克隆抗体的制备及鉴定

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免疫学杂志 2002年第6期18卷 465-467页

作者：王更银陈兴白云周镜然李烛姜曼白求恩国际和平医院输血科河北石家庄050082 第三军医大学免疫学教研室重庆400038

目的　研制针对人补体膜攻击复合物 (MAC)新抗原的特异性单克隆抗体。方法　在兔红细胞表面组装人MAC ,分离纯化RBC膜蛋白。以初步纯化的MAC免疫Balb c小鼠 ,取免疫小鼠脾细胞与SP2 0骨髓瘤细胞融合 ,采用免疫斑点杂交的方法分别以纯... 详细信息

目的　研制针对人补体膜攻击复合物 (MAC)新抗原的特异性单克隆抗体。方法　在兔红细胞表面组装人MAC ,分离纯化RBC膜蛋白。以初步纯化的MAC免疫Balb c小鼠 ,取免疫小鼠脾细胞与SP2 0骨髓瘤细胞融合 ,采用免疫斑点杂交的方法分别以纯化的单一补体成分C5、C6、C7、C8、C9和MAC同时进行阴性和阳性筛选。结果　获得了 2株仅与MAC反应而不与各单体成分反应的单克隆抗体。进一步以体外组装的补体终末复合物进行鉴定 ,证实所获单克隆抗体可特异性识别MAC复合物中C9分子暴露出的新抗原。经ELISA法测定 ,2株杂交瘤细胞的培养上清液和腹水效价分别为 1× 1 0 -3 ,1× 1 0 -3和 1× 1 0 -6,1× 1 0 -7;单克隆抗体的重链均属小鼠IgG1亚类 ,轻链均为κ型。结论　获得了 2株特异性识别MAC新抗原的单克隆抗体。

关键词：补体膜攻击复合物新抗原单克隆抗体制备鉴定

补体攻膜复合物细胞非致死性效应及其信号转导机制

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免疫学杂志 2000年第Z1期16卷 1-4页

作者：周镜然白云朱锡华第三军医大学免疫学教研室全军免疫学研究所重庆400038

有核细胞能通过自身机制抵抗同源补体溶破 ,同时亚溶破 MAC在细胞膜上沉积后 ,能刺激多种细胞的多种生物学活性改变 ,包括产生活性氧、释放花生四烯酸及其代谢产物、产生多种细胞因子、诱导膜蛋白表达和诱导细胞进入细胞周期等 ,此称 MA... 详细信息

有核细胞能通过自身机制抵抗同源补体溶破 ,同时亚溶破 MAC在细胞膜上沉积后 ,能刺激多种细胞的多种生物学活性改变 ,包括产生活性氧、释放花生四烯酸及其代谢产物、产生多种细胞因子、诱导膜蛋白表达和诱导细胞进入细胞周期等 ,此称 MAC的细胞非致死效应。这些效应是由 MAC活化细胞跨膜信号转导机制介导的。

关键词：补体膜攻击复合物细胞刺激效应信号传导

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微量免疫法制备小鼠抗人补体C9抗血清

免疫学杂志 2002年第4期18卷 306-307页

作者：黎万玲周镜然王更银白云第三军医大学免疫学教研室全军免疫学研究所重庆400038 白求恩国际和平医院输血科河北石家庄050082

目的　建立一种简便有效的免疫方法 ,制备抗人补体C9抗血清。方法　将鉴定好纯度的免疫原稀释至恰当浓度 ,以硝酸纤维素膜吸附抗原 ,将之埋入小鼠背部皮下 ,并再次免疫 1～ 2次。间接ELISA法鉴定抗血清效价 ,免疫印迹实验鉴定抗血清的... 详细信息

目的　建立一种简便有效的免疫方法 ,制备抗人补体C9抗血清。方法　将鉴定好纯度的免疫原稀释至恰当浓度 ,以硝酸纤维素膜吸附抗原 ,将之埋入小鼠背部皮下 ,并再次免疫 1～ 2次。间接ELISA法鉴定抗血清效价 ,免疫印迹实验鉴定抗血清的免疫反应特异性。结果　间接酶联免疫吸附实验滴定抗血清的效价约为 1× 10 -5,抗血清对正常人血清成分进行的免疫杂交实验得到特异性的C9蛋白条带。结论　以硝酸纤维素膜吸附抗原的微量免疫方案获得特异性和效价均佳的免疫效果。

关键词：硝酸纤维素膜免疫学免疫印进法微量免疫法抗人补体C9抗血清

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人脐静脉内皮细胞清除补体攻膜复合物的机制

免疫学杂志 2002年第1期18卷 6-8,16页

作者：周镜然朱锡华白云姜曼黎万玲第三军医大学免疫学教研室重庆400038

目的　探明内皮细胞清除补体攻膜复合物 (MAC)的途径及其清除动力学。方法　原代培养的人脐静脉内皮细胞以RH4 14荧光标记质膜双层 ,0℃组装亚溶破剂量的MAC ,37℃复苏后 ,LSCM实时监测MAC沉积诱导的质膜囊泡化形成和胞吞、胞吐情况。... 详细信息

目的　探明内皮细胞清除补体攻膜复合物 (MAC)的途径及其清除动力学。方法　原代培养的人脐静脉内皮细胞以RH4 14荧光标记质膜双层 ,0℃组装亚溶破剂量的MAC ,37℃复苏后 ,LSCM实时监测MAC沉积诱导的质膜囊泡化形成和胞吞、胞吐情况。流式细胞仪定量检测内皮细胞表面MAC抗原的清除情况。结果　MAC沉积后 ,内皮细胞有活跃的质膜囊泡化形成 ,囊泡以胞吞和胞吐 2种方式离开细胞 ,并以前者占优。 37℃条件下 ,内皮细胞清除表面MAC的半衰期约为 5min。结论　内皮细胞可通过胞吞和胞吐 2种机制清除细胞表面沉积的MAC ,并以胞吞方式为主。

关键词：补体膜攻击复合物血管内皮细胞囊泡化形成脐静脉

氯胺-T氧化C5、体外组装补体膜攻击复合物及其鉴定

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第三军医大学学报 2002年第10期24卷 1229-1230页

作者：周镜然朱锡华白云姜曼黎万玲第三军医大学基础医学部全军免疫学研究所重庆400038

目的　利用氧化的方法在无酶解反应发生的情况下获得活化形式的C5 ,进而实现以纯化的补体终末成分体外组装补体膜攻击复合物 (MAC)。方法　以蛋氨酸氧化剂氯氨 T与纯化的C5相互作用后 ,加入C6组装具溶血活性的C5 6复合物。以此复合物与... 详细信息

目的　利用氧化的方法在无酶解反应发生的情况下获得活化形式的C5 ,进而实现以纯化的补体终末成分体外组装补体膜攻击复合物 (MAC)。方法　以蛋氨酸氧化剂氯氨 T与纯化的C5相互作用后 ,加入C6组装具溶血活性的C5 6复合物。以此复合物与NHS或纯化的后续终末补体成分组装MAC ,检测复合物的溶血活性。结果　反应性溶破实验证实 ,氯胺 T氧化C5与C6组装形成功能C5 6复合物 ,后者可与NHS或纯化的补体终末成分C7～C9体外组装具溶血活性的MAC ,并且所形成的C5 6复合物在 2 4h达到最大的溶血活性 ,48h仍保持稳定。结论　氯胺 T在不裂解C5的条件下产生了C5b样活性分子 ,该分子能与C6组装形成稳定的活性复合物 ,并可与其它补体终末成分组装产生活性MAC。

关键词： C5 补体膜攻击复合物补体终末成分氯氨-T

脱脂棉及尼龙棉柱分离纯化T淋巴细胞的比较研究

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免疫学杂志 2003年第4期19卷 309-311页

作者：姜曼许桂莲黎万玲周镜然吴玉章第三军医大学免疫学研究所重庆400038

目的　建立脱脂棉柱纯化人外周血T淋巴细胞的方法 ,并与尼龙棉柱分离法进行比较。方法　密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞 ,通过玻璃器皿黏附的方法去除其中的单核巨噬细胞 ,再分别以脱脂棉柱或尼龙棉柱纯化T淋巴细胞。纯化的T淋... 详细信息

目的　建立脱脂棉柱纯化人外周血T淋巴细胞的方法 ,并与尼龙棉柱分离法进行比较。方法　密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞 ,通过玻璃器皿黏附的方法去除其中的单核巨噬细胞 ,再分别以脱脂棉柱或尼龙棉柱纯化T淋巴细胞。纯化的T淋巴细胞经流式细胞仪检测T淋巴细胞纯度 ,台盼蓝排斥实验检测纯化T细胞活力。结果　脱脂棉及尼龙棉柱滤过法对纯化T细胞的活力均无影响。

关键词：脱脂棉尼龙棉柱分离纯化 T淋巴细胞比较研究

补体膜攻击复合物刺激血管内皮细胞胞浆游离钙离子浓度的变化

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细胞与分子免疫学杂志 2002年第4期18卷 342-344页

作者：周镜然朱锡华姜曼黎万玲韩根成白云第三军医大学基础医学部免疫学教研室重庆400038

目的　在单个细胞水平 ,观测亚溶破补体膜攻击复合物 (MAC)诱导的血管内皮细胞 [Ca2 + ]i的动态变化。方法将原代培养的人脐静脉内皮细胞 ,以Fluo 4 /AM(1～ 6 μmol/L)和 0 .0 2 %PluronicF 12 7进行细胞钙荧光指示剂负载后 ,于 0℃组... 详细信息

目的　在单个细胞水平 ,观测亚溶破补体膜攻击复合物 (MAC)诱导的血管内皮细胞 [Ca2 + ]i的动态变化。方法将原代培养的人脐静脉内皮细胞 ,以Fluo 4 /AM(1～ 6 μmol/L)和 0 .0 2 %PluronicF 12 7进行细胞钙荧光指示剂负载后 ,于 0℃组装亚溶破剂量的MAC。在 37℃条件下 ,以LSCM实时监测MAC沉积引起的胞浆钙荧光强度的变化。结果　MAC沉积后 ,多数细胞的钙荧光强度迅速增强 ,以后随时间的推移 ,升高的钙荧光逐渐下降 ,直至恢复至静息水平。定量分析选定的胞浆区域钙荧光强度的变化发现 ,不同细胞在 [Ca2 + ]i 的变化高度、持续时间和胞内钙振荡的特征等方面存在异质性。结论　MAC沉积到内皮细胞表面后 ,可诱导胞浆游离钙离子的浓度增高 ,且不同细胞 [Ca2 + ]i

关键词：补体膜攻击复合物血管内皮细胞游离钙激光共聚焦显微镜

IgG型抗CD55×抗β-Gal基因工程双特异性抗体的构建

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免疫学杂志 2003年第4期19卷 281-284页

作者：韩根成朱锡华白云周镜然姜曼黎万玲第三军医大学免疫学教研室重庆400038

目的　探讨用生物学方法治疗病毒感染性疾病及肿瘤的新途径。方法　以有重要补体活化调节功能的膜补体调节蛋白CD5 5为靶点 ,以 β GaL为模拟病毒或肿瘤抗原 ,制备“IgG”型抗CD5 5×抗 β Gal基因工程双特异性抗体 ,并对该重组抗体真... 详细信息

目的　探讨用生物学方法治疗病毒感染性疾病及肿瘤的新途径。方法　以有重要补体活化调节功能的膜补体调节蛋白CD5 5为靶点 ,以 β GaL为模拟病毒或肿瘤抗原 ,制备“IgG”型抗CD5 5×抗 β Gal基因工程双特异性抗体 ,并对该重组抗体真核表达后的结合活性进行初步的验证。结果　克隆的CD5 5抗体可变区片段为新的小鼠抗体可变区片段 ,经HEK 2 93细胞表达后的重组抗体显示了良好的CD5 5及Fc结合活性。

关键词： IgG型抗CD55×抗β-Gal基因工程双特异性抗体构建免疫生物学治疗膜补体调节蛋白