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作者：周薇帆河南农业大学

学位级别：硕士

禽腺病毒(FAd V)遍布世界各地,起初FAd V分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个群,后来依据交叉中和反应结果将FAd V分为12个血清型(FAd V-1～8a和8b～11),依据其分子结构特征分为5个种(FAd V-A～E),12个血清型均能导致IBH,死亡率接近10%,典型特征是肝脏坏... 详细信息

禽腺病毒(FAd V)遍布世界各地,起初FAd V分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个群,后来依据交叉中和反应结果将FAd V分为12个血清型(FAd V-1～8a和8b～11),依据其分子结构特征分为5个种(FAd V-A～E),12个血清型均能导致IBH,死亡率接近10%,典型特征是肝脏坏死。FAd V-1(CELOV)也能导致肌胃糜烂。包涵体肝炎-心包积液综合征(HHS)是FAd V引起的最严重的疾病,大部分由4型和8型禽腺病毒引发。1986年,心包积液综合征首次出现在巴基斯坦地区,随后逐渐蔓延到世界各地。2012年开始,国内养殖场开始出现由FAd V引发的包涵体肝炎、心包积液的病例。2015年,国内多个省份FAd V感染的情况持续加剧,鸡群表现突然发病,死亡率高达30%～70%,给国内养鸡业造成了严重的经济损失。近几年,世界各地的HHS病例也呈上升趋势,包括印度、加拿大、日本、韩国等。2015年河南某鸡场暴发了HHS,为研究其致病机制,本研究采集发病鸡的肝脏和心包积液,研磨后吸取上清液,在CEL上进行分离纯化,可见细胞明显病变,脱落呈葡萄串状聚集。命名分离株为K株,提取纯化后病毒的DNA,进行PCR扩增,对扩增产物进行测序,与Genbank中其他腺病毒进行氨基酸序列同源性分析和遗传进化分析,结果表明,本研究分离的K株与C种血清4型的FAd V同源性高达93.6%,亲缘关系最近,说明K株为C种血清4型的FAd V。同时对K株进行生物学特性研究,K株接种1日龄、64日龄、220日龄SPF鸡,结果都达到100%死亡,表明K株致病性很强。用福尔马林灭活的K株的20%肝组织匀浆与ISA71 VG佐剂高速剪切制备油乳苗,为了探究能够有效预防鸡HHS疫苗所需的最小病毒量,制备了分别含10TCID、10TCID、10TCID、10TCID的4种不同病毒量的油乳苗,免疫3周龄SPF鸡,并设置对照组,免疫4周后,各组接种10TCID的K株,每天观察鸡的精神状态,记录死亡时间,一直持续到攻毒后14天。根据攻毒保护试验的结果,表明A组制备的疫苗最低应含有10TCID病毒量可以实现对鸡群的完全保护,说明K株有很好的免疫原性,可以作为制备预防禽腺病毒感染的疫苗的候选毒株。为适用于FAd V临床的大批量检测,本研究利用K株制备的标准品建立TaqMan探针荧光定量PCR方法检测FAd V,扩增效率高达93.87%,相关系数为0.998接近于1,特异性高,重复性好,最低检测FAd V模板浓度为2×10copies/u L,与常规PCR相比,敏感10倍,对促进养禽业健康发展具有重要意义。应用建立的荧光PCR方法检测K株感染3周龄SPF鸡后对不同组织的嗜性,结果表明,3周龄SPF鸡感染K株后,在鸡的组织中广泛分布,组织中K株的病毒量在3dpi能检测出拷贝数,8dpi时病毒量最高,其中肝脏的病毒拷贝数最高为2.208×10copies/g,心脏的病毒拷贝数为2.723×10copies/g,在胸腺中的病毒量最少,为8.710×10copies/g,说明K株对肝脏的嗜性最大,对胸腺的嗜性最小,为广嗜性病毒。

关键词：禽腺病毒 TaqMan探针荧光定量PCR 致病性免疫原性

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IBDV细胞适应株的驯化及其VP2基因的分子特征分析

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2018年第8期46卷 1-8页

作者：王洁琼赵玉杰周薇帆周云飞陈田田刘建勋李新生河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

【目的】对从河南某地区发病鸡群中分离出的1株IBDV进行驯化使适应永生细胞DF-1,并对其VP2基因进行克隆和生物信息学分析,对IBDV分离株及其细胞适应株的VP2高变区及七肽区进行比较。【方法】测定IBDV分离株X1对10日龄SPF鸡胚的半数致死... 详细信息

【目的】对从河南某地区发病鸡群中分离出的1株IBDV进行驯化使适应永生细胞DF-1,并对其VP2基因进行克隆和生物信息学分析,对IBDV分离株及其细胞适应株的VP2高变区及七肽区进行比较。【方法】测定IBDV分离株X1对10日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50);通过SPF鸡胚-CEF-DF-1途径对X1进行驯化,使其适应永生细胞DF-1;根据IBDVVP2基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV分离株和细胞适应株的VP2基因并测序,将其与参考毒株进行同源性和进化树分析,同时对二者在VP2高变区及七肽区的推导氨基酸序列进行对比分析。【结果】IBDV分离株X1对10日龄SPF鸡胚的ELD_(50)为10-8 mL^(-1),经驯化获得了细胞适应株C1。对2株病毒的VP2基因进行克隆并鉴定,测序分析得IBDV X1株在第222,256,294和299位上具有A、I、I、S4个特征性氨基酸,与IBDV超强毒株(vvIBDV)HK46 VP2基因氨基酸序列的同源性高达99.3%,确定X1株为IBDV超强毒株。同源性及进化树分析结果显示,C1株与IBDV减毒株CEF94亲缘关系较近,同源性较高,为99.6%,确定C1株为IBDV减毒株。在VP2高变区及七肽区推导氨基酸比对中显示,C1株第330位精氨酸R取代了X1株在330位的丝氨酸S;第222位氨基酸由A变成P;决定病毒毒力的位点第256和284位分别由I、A变为V和T。【结论】成功驯化了1株vvIBDV使其适应细胞,初步揭示vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化的过程中,VP2高变区及七肽区氨基酸序列有明显变化。

关键词：传染性法氏囊病毒 VP2基因基因克隆序列分析

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传染性法氏囊病病毒C4毒株VP2基因的原核表达及生物信息学分析

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中国畜牧兽医 2017年第12期44卷 3585-3591页

作者：王洁琼赵玉杰周云飞黄宗梅陈盼盼周薇帆刘琳李新生河南农业大学牧医工程学院郑州450002

试验旨在研究一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)河南分离株的毒力特征及其与VP2氨基酸序列特征的关系。通过提取IBDV C4株RNA,利用RT-PCR扩增其VP2基因,与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及推导的氨基酸序列比对分析,同时使用pET-32a(+)原... 详细信息

试验旨在研究一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)河南分离株的毒力特征及其与VP2氨基酸序列特征的关系。通过提取IBDV C4株RNA,利用RT-PCR扩增其VP2基因,与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及推导的氨基酸序列比对分析,同时使用pET-32a(+)原核表达载体表达VP2基因,用SDS-PAGE和Western blotting检测重组VP2蛋白的表达。结果显示,扩增的IBDV C4株的VP2基因序列在进化关系上属于超强毒力IBDV(vvIBDV)分类,与选取的vvIBDV毒株代表毒株核苷酸序列同源性在98.1%~98.7%之间,其七肽区为S-W-S-AS-G-S(第326—332位氨基酸)符合超强毒株特征,且222(A)、256(I)、294(I)和299(S)位氨基酸与超强毒力毒株的4个特征性氨基酸一致;但IBDV C4毒株的VP2蛋白氨基酸序列与超强毒力毒株代表毒株UK661相比,201(D/G)、281(G/R)、313(V/A)位氨基酸不同,其中281位氨基酸的改变处于279—290的小亲水区内,与病毒抗原性有关;构建的pET-32a(+)-VP2原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞上表达出分子质量约67ku的重组VP2蛋白,为进一步比较201(G)、281(R)、313(A)位氨基酸差异导致的抗原特性改变提供了研究基础。本试验结果表明,IBDV C4株VP2基因与vvIBDV毒株VP2基因的主要特性一致,但也有3处氨基酸与代表毒株UK661存在差异,这些改变可能与中国IBDV毒株毒力的进化有关。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2 分子特征原核表达

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1株Ⅰ群血清4型禽腺病毒对SPF鸡的致病性

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中国兽医学报 2018年第9期38卷 1666-1669页

作者：周薇帆陈田田刘建勋赵玉杰王洁琼刘琳陈盼盼李新生河南农业大学牧医工程学院

用实验室保存的1株血清4型禽腺病毒（FAdV-4）W株对雏鸡（1dSPF鸡）进行攻毒试验,研究其致病性及免疫原性,每日观察鸡只精神状态,持续14d,计算死亡率,对每组死亡鸡只立即剖检,记录眼观组织病变,并将肝脏固定于10%的福尔马林中用于组织... 详细信息

用实验室保存的1株血清4型禽腺病毒（FAdV-4）W株对雏鸡（1dSPF鸡）进行攻毒试验,研究其致病性及免疫原性,每日观察鸡只精神状态,持续14d,计算死亡率,对每组死亡鸡只立即剖检,记录眼观组织病变,并将肝脏固定于10%的福尔马林中用于组织学观察。SPF鸡攻毒试验结果表明,口服接种100TCID50病毒量对1dSPF鸡的致死率高达100%,死亡时间在144~150h之间;对死亡鸡只剖检均可见到明显的心包积液,肝脏出血坏死;肝组织切片HE染色可见典型的嗜碱性核内包涵体。用该病毒制备的灭活疫苗具有良好的免疫保护作用,制作的高免血清也具有良好的治疗效果。

关键词： 4型禽腺病毒攻毒试验致病性免疫原性

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Ⅰ群4型禽腺病毒不同增殖方式的比较

Ⅰ群4型禽腺病毒不同增殖方式的比较

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中国畜牧兽医学会2017年学术年会

作者：周薇帆王洁琼赵玉杰周云飞刘琳陈盼盼李新生河南农业大学牧医工程学院

引言禽腺病毒通常被认为广泛存在于健康鸡只和死亡鸡只中,这一认识在1987年安卡拉地区暴发因典型症状被命名为包涵体肝炎-心包积液综合征(HHS)而发生改变。随后,用该地区病料分离出的4型禽腺病毒(FAdV-4)在SPF鸡上能复制出HHS,才确定了...

引言禽腺病毒通常被认为广泛存在于健康鸡只和死亡鸡只中,这一认识在1987年安卡拉地区暴发因典型症状被命名为包涵体肝炎-心包积液综合征(HHS)而发生改变。随后,用该地区病料分离出的4型禽腺病毒(FAdV-4)在SPF鸡上能复制出HHS,才确定了此病的病因。目前,国内没有商品化的疫苗应对HHS,为了选择一种最好的繁殖病毒的方法研究禽腺病毒疫苗,本实验室从自然发病死亡的鸡只中分离出了一株Ⅰ群4型禽腺病毒,用三种不同方式增殖病毒,比较不同增殖方式对禽腺病毒增殖能力的影响。材料与方法

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不同消毒剂抑菌效果观察

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河南畜牧兽医（综合版） 2017年第1期38卷 6-7页

作者：王洁琼赵玉杰周薇帆周云飞陈盼盼李新生河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

针对3种常见的致病菌（金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌），选取3种消毒剂，检测对比其抑菌效果。方法：使用普通肉汤对3种消毒剂进行不同比例稀释，分别接种10μl×10^11CFU／ml的金黄色葡萄球菌菌悬液、沙门氏菌菌悬液和大肠杆菌... 详细信息

针对3种常见的致病菌（金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌），选取3种消毒剂，检测对比其抑菌效果。方法：使用普通肉汤对3种消毒剂进行不同比例稀释，分别接种10μl×10^11CFU／ml的金黄色葡萄球菌菌悬液、沙门氏菌菌悬液和大肠杆菌菌悬液，培养8h和24h后，根据OD值测定结果判断其抑菌效果。戊二醛癸甲溴铵溶液在低浓度下即可抑制3种细菌生长，为综合效果较好的消毒剂，稀戊二醛溶液需适当提高浓度或延长时间才能有效抑菌；聚维酮碘溶液在高浓度下才可有效抑菌，低浓度下存在抑菌无效的情况。3种消毒剂对沙门氏菌、葡萄球菌抑菌效果相对较好，对大肠杆菌抑菌效果相对较差。

关键词：消毒剂稀释度 OD值抑菌效果

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江海扬帆五十春——中山市港航企业集团有限公司成立50周年

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珠江水运 2003年第4期 F004-F004页

作者：周薇

3月18日，伴随着神湾港正式开港，中山港航集团走过了风雨兼程的半世纪。

关键词：有限公司企业集团中山市帆神湾港中山港

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