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***感染雏鸡脾脏差异表达基因的cDNA-SRAP分析

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作者：周晏丞西南大学

学位级别：硕士

球虫病是集约化养鸡业最为高发且危害严重的一类寄生虫病,在我国发病率较高,经济损失巨大,其中柔嫩艾美耳球虫为危害最强最严重的虫种。尽管近年来对球虫免疫学研究越来越深入,但由于球虫复杂的生活史,庞大的基因组等问题,导致现阶段对... 详细信息

球虫病是集约化养鸡业最为高发且危害严重的一类寄生虫病,在我国发病率较高,经济损失巨大,其中柔嫩艾美耳球虫为危害最强最严重的虫种。尽管近年来对球虫免疫学研究越来越深入,但由于球虫复杂的生活史,庞大的基因组等问题,导致现阶段对球虫入侵和宿主防御的分子机制还不明确,感染引起宿主基因的表达变化也不清楚。本研究通过c DNA-SRAP技术筛选和分析与***感染相关基因,加强对***和宿主之间相互作用的研究,为从转录组水平上揭示***与宿主间的相互作用规律奠定基础。主要研究结果如下:(1)雏鸡脾脏RNA样本的c DNA-SRAP体系的建立。用Trizol法提取14日龄雏鸡脾脏总RNA,采用SMART Scribe Reverse Transcriptase试剂盒进行反转录,以脾脏c DNA为模板,以单因素试验设计和正交试验设计对c DNA-SRAP反应体系进行优化,获得最佳反应体系和扩增程序。反应体系为:d NTPs:0.25m M;Mg2+:2.0m M;Taq聚合酶:2.25U;引物:0.55μM;模板c DNA:20ng。扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸1min,共5个循环,94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环,72℃延伸10min。利用优化好的程序和体系进行c DNA-SRAP扩增,能够获得条带清晰、多态性好的扩增条带。(2)***感染雏鸡脾脏转录组c DNA-SRAP分析。以雏鸡脾脏c DNA为模板,采用最优扩增体系及程序,通过256对c DNA-SRAP任意引物对感染组和对照组进行扩增,经1.6%琼脂糖凝胶电泳和紫外分析,对差异显著的条带进行回收。初次筛选后感染组共获得12个上调表达基因,通过动物实验和c DNA-SRAP对该12个基因进行验证后,经过二次PCR、克隆测序后共获得9个基因序列。在NCBI中通过BLAST-N工具进行在线比对,结果显示9个基因均有高度同源性序列,其中6个为已知功能基因,分别为MLL5蛋白基因(XM03640341.2)、嘌呤受体P2RY8基因(XM11588440.1)、磷脂酶PLCD1基因(XM04939119.2)、亮氨酸氨基肽酶LAP3基因(XM10220558.1)、IL-17 RA基因(XM13172986.1)、Wolf-Hirschhom畸变综合征的候选相关基因WHSC1L1基因(XM15297415.1)。(3)***感染雏鸡脾脏差异表达基因定量分析。对6个功能基因设计特异性引物,采用SYBR Green I法进行Real time RT-PCR定量分析。结果表明感染***后,MLL5基因上调表达1.52倍、P2RY8基因上调表达2.33倍、PLCD1基因上调表达1.48倍、LAP3基因上调表达1.57倍、IL-17RA基因上调表达1.41倍、WHSC1L1基因上调表达1.73倍。对数据进行独立样本T检验显著性分析,其中P2RY8、WHSC1L1基因为极显著差异(P<0.01),MLL5、PLCD1、LAP3、IL-17 RA为显著差异(P<0.05)。***感染雏鸡能够引起脾脏中MLL5、P2RY8、PLCD1、LAP3、IL-17RA和WHSC1L1基因的上调,表明在***感染宿主早期,上述基因发生表达变化可能与***入侵宿主以及宿主的防御机制相关。PLCD1能够放大Ca2+信号调节途径,参与固有免疫反应,LAP3帮助抗原肽在膜表面形成MHCI类分子复合物,IL-17RA作为细胞因子受体参与炎症反应过程,三个基因具有的免疫学功能预示其表达变化可能与球虫感染引起的免疫反应相关;MLL5基因具有促进细胞增殖的作用,WHSC1L1基因多与癌症发展过程相关,P2RY8基因具体功能还不太明确,三者同球虫感染相关作用机制仍然需要进一步研究。

关键词：柔嫩艾美耳球虫 cDNA-SRAP 转录组 Real Time RT-PCR

养殖环境中耐氟喹诺酮类药物大肠杆菌gyrA基因的检测与序列分析

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西南大学学报（自然科学版） 2014年第9期36卷 9-14页

作者：曹立亭周晏丞仲崇华陈鑫马跃西南大学(荣昌校区)动物医学系重庆荣昌402460 农标普瑞纳(重庆)饲料有限公司重庆荣昌402460

该文探讨从养殖场动物、环境、饲养员等分离的大肠杆菌耐氟喹诺酮类药物的靶位基因gyrA突变特征.对养殖环境中分离的8株大肠杆菌进行临床常用氟喹诺酮类药物的耐药性分析、PCR扩增gyrA基因并测序,并采用DNASTAR软件对gyrA基因的氟喹诺... 详细信息

该文探讨从养殖场动物、环境、饲养员等分离的大肠杆菌耐氟喹诺酮类药物的靶位基因gyrA突变特征.对养殖环境中分离的8株大肠杆菌进行临床常用氟喹诺酮类药物的耐药性分析、PCR扩增gyrA基因并测序,并采用DNASTAR软件对gyrA基因的氟喹诺酮耐药决定区进行生物信息学分析.结果表明:养殖场环境中分离的菌株编号为1,6和8的3株大肠杆菌对环丙沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星敏感,菌株2,3,4,5和7的5株大肠杆菌对环丙沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星耐药;氨基酸序列分析发现,敏感菌株氨基酸位点未发生突变或83位发生单突变;耐药菌株的突变发生在83位Ser→Leu替代和87位Asp→Asn替代,且发生氨基酸双替代的菌株均为高度耐药菌株.表明不同来源的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌gyrA基因的氨基酸变异具有多种类型,该研究将更好地诠释养殖场大肠杆菌的氟喹诺酮类耐药机制.

关键词：大肠杆菌氟喹诺酮类药物耐药性 gyrA基因

随机ssDNA文库不对称PCR扩增条件的优化及回收效率比较

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四川畜牧兽医 2015年第11期42卷 33-35,37页

作者：周晏丞曹立亭陈露马跃西南大学荣昌校区动物医学系重庆荣昌402460

本研究开展了SELEX技术中ssDNA文库不对称PCR扩增及回收条件的优化试验,结果得出:20μL不对称PCR反应体系中上下游引物的最佳比例为60∶1,最优循环数为30个循环,回收效率最高的方法为乙醇沉淀法。此条件下,随机ssDNA文库不对称PCR扩增... 详细信息

本研究开展了SELEX技术中ssDNA文库不对称PCR扩增及回收条件的优化试验,结果得出:20μL不对称PCR反应体系中上下游引物的最佳比例为60∶1,最优循环数为30个循环,回收效率最高的方法为乙醇沉淀法。此条件下,随机ssDNA文库不对称PCR扩增出来的条带清晰、稳定、特异性高,并具有较好的纯化效率。

关键词：配基系统进化技术 ssDNA文库不对称PCR DNA纯化

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体内诱导抗原技术研究进展

动物医学进展 2016年第2期37卷 75-80页

作者：周晏丞郭玉洁陈露曹立亭马跃西南大学荣昌校区动物医学系重庆荣昌402460

体内诱导抗原技术(IVIAT)作为一种新兴的体内诱导基因筛选技术,相比其他筛选技术具有不需要动物模型的显著优势。大量试验证实体内诱导基因可能与病原微生物在机体内生存以及致病性相关,同时其表达产物也是良好的药物靶标和疫苗候选基... 详细信息

体内诱导抗原技术(IVIAT)作为一种新兴的体内诱导基因筛选技术,相比其他筛选技术具有不需要动物模型的显著优势。大量试验证实体内诱导基因可能与病原微生物在机体内生存以及致病性相关,同时其表达产物也是良好的药物靶标和疫苗候选基因。论文综述了IVIAT的原理、操作步骤及优缺点,由于现阶段该技术在寄生虫病上应用较少,因此分析了其在寄生虫病上所具有的优势和可能存在的问题。

关键词：体内诱导抗原技术体内诱导基因寄生虫病

某牛场粪源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定

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四川畜牧兽医 2015年第7期42卷 25-27页

作者：陈露曹立亭周晏丞廖春玉西南大学荣昌校区动物医学系重庆荣昌402460

为了解重庆市某牛场牛群大肠杆菌O157∶H7的感染情况,我们以牛场犊牛为研究对象,采集其新鲜粪便,经LB培养基增菌培养、免疫磁珠富集后,在山梨醇麦康凯琼脂上划线培养,最后PCR扩增eae A基因目的片段,以此分离鉴定粪源大肠杆菌O157∶H7。... 详细信息

为了解重庆市某牛场牛群大肠杆菌O157∶H7的感染情况,我们以牛场犊牛为研究对象,采集其新鲜粪便,经LB培养基增菌培养、免疫磁珠富集后,在山梨醇麦康凯琼脂上划线培养,最后PCR扩增eae A基因目的片段,以此分离鉴定粪源大肠杆菌O157∶H7。结果显示:在所采集的39份犊牛粪便样品中,分离得到一株符合大肠杆菌O157∶H7生长特点且含有eae A基因的菌株。

关键词：大肠杆菌0157∶H7 PCR技术免疫磁珠法

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后海穴注射黄芪多糖对脾虚泄泻犬的治疗效果

中国兽医学报 2015年第2期35卷 314-318页

作者：曹立亭彭代国马跃周晏丞牛晓艺仲崇华西南大学荣昌校区动物医学系重庆荣昌402460 西南大学荣昌校区动物科学系重庆荣昌402460

32只健康本地犬饲养1周后按体质量灌胃番泻叶水煎剂6 m L/kg人工复制脾虚泄泻证病理模型,造模成功后随机分为4组:黄芪多糖治疗组后海穴注射黄芪多糖注射液0.25 m L/kg,2次/d;硫酸庆大霉素治疗组后海穴注射硫酸庆大霉素注射液0.2 m L/kg,... 详细信息

32只健康本地犬饲养1周后按体质量灌胃番泻叶水煎剂6 m L/kg人工复制脾虚泄泻证病理模型,造模成功后随机分为4组:黄芪多糖治疗组后海穴注射黄芪多糖注射液0.25 m L/kg,2次/d;硫酸庆大霉素治疗组后海穴注射硫酸庆大霉素注射液0.2 m L/kg,2次/d;后海穴针刺组后海穴注射生理盐水0.25 m L/kg,2次/d;病理对照组不作任何处理;同时设立4头健康犬作为空白对照,造模期间灌胃生理盐水。用药后治疗期间测定试验犬只的体质量、三大临床指标、部分血液指标和脾脏指数,并统计分析。结果表明,黄芪多糖治疗组血红蛋白、红细胞水平在较短时间内恢复正常,脾脏指数显著(P<0.05)高于硫酸庆大霉素治疗组;硫酸庆大霉素治疗组白细胞降低速度极显著(P<0.01)快于黄芪多糖治疗组。这表明后海穴注射黄芪多糖注射液可以用于治疗犬脾虚泄泻证。

关键词：犬黄芪多糖注射液硫酸庆大霉素注射液后海穴脾虚泄泻治疗效果

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不同免疫途径对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响

四川畜牧兽医 2013年第5期40卷 29-30,33页

作者：许李丽周晏丞杨凡李佳鸿曹立亭西南大学荣昌校区动物医学系重庆荣昌402460

为探讨不同免疫接种途径对鸡新城疫(ND)弱毒疫苗免疫效果的影响,我们将健康1日龄海兰蛋公鸡雏鸡(48只)随机分为滴鼻免疫组、肌肉注射免疫组、后海穴常规剂量免疫组和后海穴半剂量免疫组,每组12只。分别于第14日龄和28日龄接种新城疫IV... 详细信息

为探讨不同免疫接种途径对鸡新城疫(ND)弱毒疫苗免疫效果的影响,我们将健康1日龄海兰蛋公鸡雏鸡(48只)随机分为滴鼻免疫组、肌肉注射免疫组、后海穴常规剂量免疫组和后海穴半剂量免疫组,每组12只。分别于第14日龄和28日龄接种新城疫IV系弱毒苗(LaSota株)1羽份/只,后海穴半剂量免疫组接种0.5羽份/只。分别于免疫前和免疫后7、14、21d和28d称重,无菌操作采血,分离血清,检测血清中的血凝抑制效价(HI)。结果显示:与常规途径免疫组相比,后海穴常规剂量免疫组和后海穴半剂量免疫组可显著增强鸡血清NDV特异性HI效价(P0.05)。试验结果说明后海穴接种鸡新城疫疫苗可显著提高鸡血清NDV的HI效价,提高鸡生产性能,同时节约疫苗用量。

关键词：新城疫疫苗后海穴免疫肌注免疫滴鼻免疫免疫效果

***感染早期雏鸡盲肠扁桃体ChIL-17A和ChIL-17F表达水平的相反变化

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中国兽医学报 2016年第12期36卷 2074-2080,2085页

作者：陈露周晏丞曹立亭董世起廖春玉郭玉洁黎春秀马跃西南大学荣昌校区动物医学系重庆荣昌402460

为探讨ChIL-17及其受体在抗柔嫩艾美耳球虫（***）感染中的作用，本研究用***株孢子化卵囊口服感染14日龄非免疫蛋公鸡，于感染后0，2，4，6，12，24，3，5，7d共9个不同时间点同时提取对照组和试验组雏鸡盲肠扁桃体RNA，采用实时荧光定... 详细信息

为探讨ChIL-17及其受体在抗柔嫩艾美耳球虫（***）感染中的作用，本研究用***株孢子化卵囊口服感染14日龄非免疫蛋公鸡，于感染后0，2，4，6，12，24，3，5，7d共9个不同时间点同时提取对照组和试验组雏鸡盲肠扁桃体RNA，采用实时荧光定量PCR方法检测ChIL-17A、ChIL-17F和ChIL-17RA基因的表达动态。结果显示，ChIL-17A表达水平在感染后持续下调，感染后4h为感染前（0h）的0．13倍（P〈0．01），感染后3d达最低表达水平，仅为感染前（0h）的0．0097倍。而ChIL-17F的表达水平则呈现相反的变化，在感染早期明显上调，感染后2h上调3．07倍（P〈O．05），感染后4h上调6．49倍（P〈0．01），其后时间点与感染前相比表达水平则无显著性差异。ChIL-17RA与感染前相比表达上调，于感染后24h和7d分别上调1．73倍和2．21倍（P〈0．01）。结果表明，ChIL-17及其受体基因的表达水平在感染后均呈现显著变化，说明它们在***感染中具有重要的宿主-寄生虫免疫生物学意义。特别是ChIL-17A和ChIL-17F在感染早期（感染后2～4h）表现出显著的相反表达动态说明两者在宿主防御E-tenella感染的早期具有不同的免疫调节功能，而这一具体调节机制还有待于进一步的研究加以阐明。

关键词：柔嫩艾美耳球虫 ChIL-17F ChIL-17F ChIL-17RA 实时荧光定量PCR

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双层地下连续墙土压力的现场实测研究

岩土力学 2024年第S1期45卷 507-516页

作者：陕耀董雅丞张旭辉姚西平同济大学道路与交通工程教育部重点实验室上海市轨道交通结构耐久与系统安全重点实验室南京地铁建设有限责任公司江苏省铁路集团有限公司江苏省智能与绿色铁路工程研究中心

南京某超深基坑工程采用异形围护结构双层地下连续墙进行施工，双墙间土体处于非极限平衡状态，土压力分布演变形式及墙土间相互作用机制并不明确。为探明深基坑开挖施工引起的双墙间有限土体的土压力变化规律及墙外侧土拱效应对土压力... 详细信息

南京某超深基坑工程采用异形围护结构双层地下连续墙进行施工，双墙间土体处于非极限平衡状态，土压力分布演变形式及墙土间相互作用机制并不明确。为探明深基坑开挖施工引起的双墙间有限土体的土压力变化规律及墙外侧土拱效应对土压力分布的影响，采用现场实测分析结合物理模型计算的方法开展研究。首先，通过现场试验在土层中布设土压力监测点，获取基坑开挖过程中墙间土压力演变规律；其后，建立考虑土体分层的曲面锥形土拱模型，计算侧土拱发展引起的墙外土压力变化量，并结合试验数据的参数反演和误差分析对模型计算结果的准确性展开讨论。研究结果表明：基坑开挖施工对双墙间土体的影响总体呈现为挤压变形，有限土体受到的侧向约束作用有助于进一步发挥土体的抗剪强度；基坑开挖各工序中土方开挖过程对地层扰动最为显著；侧土拱效应进一步增大了浅层土体挡土墙侧土压力，而中深层土体中几乎没有侧土拱发展；考虑侧土拱效应的土压力计算结果较传统水土分算的Coulomb理论计算方法与现场实测结果更加吻合。本研究可为异型围护结构的深基坑工程设计及施工提供思路与建议。

关键词：地下连续墙土压力现场实测侧土拱效应对比分析