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作者：周五朵福建农林大学

学位级别：硕士

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)是以感染番鸭出现“肝白点”为主要病变特征,并可引起软脚,喜卧,趾、跗关节肿胀等症状的一种传染性很强的病毒。2001年以来,本实验室分离出多株番鸭呼肠孤病毒,其中包括不同致病力的YB株和YJ... 详细信息

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)是以感染番鸭出现“肝白点”为主要病变特征,并可引起软脚,喜卧,趾、跗关节肿胀等症状的一种传染性很强的病毒。2001年以来,本实验室分离出多株番鸭呼肠孤病毒,其中包括不同致病力的YB株和YJL株。经测序分析,YB株与MDRV法国89026株的S4基因同源性达94%以上,而YJL株与禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)S1133株、176株的S1基因之间同源率高达96%以上,YB株与YJL株之间S组基因同源性低于30%。YB毒株在临床上表现为高致病力的特点,能够引起高的致死率,YJL毒株,在临床上对番鸭表现为低致病力的特点。由于两毒株在临床症状上有着类似发病症状和致病机理,通过临床诊断鉴别比较困难,所以建立一种快速、高效、特异的检测方法对于临床上区分不同致病力毒株具有重要意义。YJL株的S1基因编码P10、P17和σ C三个蛋白,而YB株的S4基因编码P10和σC两个蛋白,不含有P17蛋白,且两个毒株的P10蛋白基因的同源性极低。根据这2株病毒基因特点,分别针对YB株P10蛋白基因和YJL株P17蛋白基因设计2对特异性引物,通过条件优化成功建立了可鉴别这2个毒株的双重RT-PCR。结果显示:该方法可同时扩增出YB288 bp、YJL441 bp长度的特异性片段,而对其他番鸭病病原无扩增结果;该方法最佳反应条件为95℃预变性5 min,94 ℃1 min,55℃ 45 s,72℃ 1 min,30 个循环,72℃延伸 10 min;该方法最低能检出10 pg YB和YJL株RNA模板;使用单重PCR和多重PCR方法对60份临床疑似病料检测验证,两者符合率为100%。结果表明该方法特异性、敏感性和重复性良好,具有快速、准确的特点,可用于这2种不同致病力毒株的鉴别。针对临床上番鸭群存在不同致病力毒株感染情况,为该病的防治增加了难度,因此对其致病机理的阐明显得尤其重要。在病毒感染的过程中,对宿主免疫器官和嗜性器官有致凋亡的作用,本研究用2株病毒(YB株与YJL株)对宿主、原代鸭胚成纤维细胞(Muscovy duck embryo fibroblasts,MDEF)感染,探讨2株病毒诱导细胞凋亡的情况。实验首先测定两毒株的TCID,用MTS法测定病毒感染后12h、24h、36h、48h、72h、96h共6个时间段的MDEF细胞活力,根据细胞活力出现的拐点时间用荧光显微镜、DNA Ladder提取、流式细胞仪检测三种方法,对病毒诱导的细胞凋亡情况进行了定性和定量检测;最后用Western Bloting检测宿主肝脏细胞、脾脏细胞以及MDEF细胞的(48h、72h)空白组、YB、YJL接毒组共12份细胞样品中的凋亡执行蛋白Caspase-3的活化水平。结果表明:YB毒株在MDEF细胞上的TCID远高于YJL毒株,为其3倍。MTS活力检测出细胞接毒组活力拐点在48h,有大幅活力降低现象,YB组活力低于YJL组。荧光显微镜在48h可观察到YB和YJL组均能诱导细胞早期凋亡,YB比YJL株表现出更多的晚期凋亡。DNA ladder检测表明,两个毒株均表现出经典的Ladder特征,YB组比YJL组时间更早,Ladder更明显,空白组未出现。流式细胞仪检测结果表明,YB组诱导组织细胞凋亡的能力高于YJL组,YB组肝脏细胞凋亡水平远高达75%,脾脏为23%,症状明显期肝脏细胞凋亡集中于中晚期,脾脏细胞凋亡分布于各个时期;YJL组肝脏、脾脏水平相差不大,均在10%左右;检测MDEF细胞凋亡发现,48h的接毒组较空白组细胞凋亡水平明显增加,72h的YB组凋亡细胞主要处于中晚期,YJL组则在早、中晚期均有分布。Western Bloting检测凋亡执行蛋白Caspase-3的活化水平发现,空白组肝脏和脾脏未见活化的Caspase-3(17KD)蛋白表达;YB组肝脏、脾脏细胞活化的Caspase-3(17KD)有明显增量表达;YJL组肝脏和脾脏则有少量活化的Caspase-3(17KD)表达。MDEF空白细胞48h和72h Caspase-3蛋白没有明显活化,MDEF细胞72h的YB组Caspase-3蛋白活化水平较空白组明显增加;YJL组Caspase-3蛋白活化水平表达量较YB组明显低了很多,72h较48h活化水平增加。本研究对2株不同致病力毒株建立了一种快速高效的双重RT-PCR诊断方法,对实际生产、实验室诊断提供借鉴;并从细胞凋亡角度对两毒株的致病机理进行了研究,确定了两毒株的感染能力,以及两毒株致细胞发生病变的时间拐点和具体的凋亡水平和时间,为后续病毒蛋白功能和相关信号通路研究提供了基础数据;从对宿主肝、脾组织进行凋亡检测结果来看,病毒致细胞凋亡在病毒感染机体机制中扮演

关键词： MDRV 双重RT-PCR 检测细胞凋亡

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一例八哥犬双侧腹股沟疝的诊断与治疗

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黑龙江畜牧兽医（下半月） 2015年第11期 93-94,236页

作者：高婷周五朵汪燕秋吴异健福建农林大学动物科学学院福州350002 福建农林大学动物科学学院中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室福州350002

腹股沟疝是宠物临床疾病中较为常见的外科疾病之一。随着社会经济的发展，人民生活水平的提高，宠物数量也呈现持续上升的趋势，腹股沟疝的病例也随之增多。腹股沟疝是指腹腔内脏器通过腹股沟区的缺损向体表突出所形成的疝，俗称“疝气”。

关键词：双侧腹股沟疝治疗诊断八哥外科疾病临床疾病社会经济犬

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番鸭源传染性支气管炎病毒PTFY株的分离鉴定

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病毒学报 2016年第2期32卷 203-209页

作者：吴晓平潘书磊周五朵吴异健黄一帆吴宝成福建农林大学动物科学学院中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室福州350002 福建农业职业技术学院动物科学系福州350007

为弄清楚2009年7月某种番鸭养殖场产蛋高峰期番鸭产蛋率、孵化率降低,蛋质量下降的原因,选择无呼吸道症状,死亡率低,剖检可见卵巢肿大充血的番鸭。为确诊该病例,进行病原体的分离与鉴定。取病番鸭卵巢组织,通过鸡胚接种实验、脂溶剂敏... 详细信息

为弄清楚2009年7月某种番鸭养殖场产蛋高峰期番鸭产蛋率、孵化率降低,蛋质量下降的原因,选择无呼吸道症状,死亡率低,剖检可见卵巢肿大充血的番鸭。为确诊该病例,进行病原体的分离与鉴定。取病番鸭卵巢组织,通过鸡胚接种实验、脂溶剂敏感实验、新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）干扰试验、电镜观察和动物接种实验进行病毒分离和鉴定。结果表明：接种鸡胚可导致侏儒胚,该毒株对于脂溶剂敏感,胰酶处理后具血凝性,可干扰NDV复制,电镜下可见典型冠状病毒形态,接种雏鸡可致呼吸道症状,针对N基因部分序列的扩增与分析可见该毒株与传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV）参考毒株相应核苷酸序列同源性为84.7%~99%,鉴定所分离毒株PTFY株为IBV,证实IBV对番鸭具有致病性。

关键词：传染性支气管炎病毒番鸭分离鉴定

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番鸭呼肠孤病毒σNS蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2015年第5期45卷 474-480页

作者：朱二鹏崔龙萍吕小婷余深翼周五朵吴异健吴晓平吴宝成福建农林大学动物科学学院福建福州350002

为制备番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株σNS蛋白的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了σNS基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-YB-σNS。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功高效表达出分子质量约为58ku的融合... 详细信息

为制备番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株σNS蛋白的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了σNS基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-YB-σNS。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功高效表达出分子质量约为58ku的融合蛋白。该融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在,表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度、诱导温度分别为4h、1mmol/L和37℃。通过对包涵体和可溶性蛋白进行尿素洗涤纯化和(或)Ni 2+柱亲和层析纯化,得到了高纯度的重组蛋白。分别对纯化前、后的重组蛋白进行Western-blot分析,结果显示两者均可以与MDRV阳性血清发生特异性反应,表明它们具备良好的反应原性。将纯化后的可溶性σNS蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶32 000。上述研究结果为后续MDRVσNS蛋白功能研究奠定了基础。

关键词：番鸭呼肠孤病毒 σNS蛋白原核表达纯化多克隆抗体

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放养土鸡非典型新城疫的病因分析及防控对策

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福建畜牧兽医 2015年第6期37卷 25-28页

作者：高婷周五朵吴异健福建农林大学动物科学学院福州350002 中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室福州350002

低发病率、低死亡率、高淘汰率、散发性的非典型新城疫是放养土鸡的主要疫病之一,其流行病学、临床症状、剖检病变等不同于传统典型新城疫,易被误诊,给土鸡养殖业造成巨大的经济损失。文中对放养土鸡非典型新城疫的流行特点、成因及防... 详细信息

低发病率、低死亡率、高淘汰率、散发性的非典型新城疫是放养土鸡的主要疫病之一,其流行病学、临床症状、剖检病变等不同于传统典型新城疫,易被误诊,给土鸡养殖业造成巨大的经济损失。文中对放养土鸡非典型新城疫的流行特点、成因及防控措施等进行概述,以期为土鸡养殖业者提供参考。

关键词：放养土鸡非典型鸡新城疫发病原因综合防控

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MDRV-YB株σNS蛋白结构与功能的生物信息学分析

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黑龙江畜牧兽医 2017年第8期 177-181,294页

作者：李安菊林绍青郑玲红孙彤朱二鹏周五朵吴异健吴宝成福建农林大学动物科学学院福州350002 福建省兽医中药与动物保健重点实验室福州350002

为了获取番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株σNS蛋白结构与功能的相关生物学信息,试验通过克隆测序获取MDRV-YB株σNS基因序列,并运用相关生物信息学软件对σNS蛋白结构与功能进行生物信息学分析。结果表明:MDRV-YB株σNS蛋白的编码区大小为1 10... 详细信息

为了获取番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株σNS蛋白结构与功能的相关生物学信息,试验通过克隆测序获取MDRV-YB株σNS基因序列,并运用相关生物信息学软件对σNS蛋白结构与功能进行生物信息学分析。结果表明:MDRV-YB株σNS蛋白的编码区大小为1 104 bp,编码367个氨基酸,为亲水性不稳定蛋白,具有4个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、28个磷酸化位点,但不含潜在的信号肽序列;二级结构分析显示,α-螺旋结构、β-折叠结构、β-转角结构、无规卷曲的氨基酸残基分别占40.2%、42.1%、8.97%和8.97%;推导氨基酸序列的遗传进化树分析显示,MDRVYB株与传统型MDRV的遗传进化关系较近,与新型MDRV及鸡源呼肠孤病毒(CRV)遗传进化关系较远。说明σNS蛋白作为非结构蛋白参与病毒的复制过程,且具有较高的保守性。

关键词：番鸭呼肠孤病毒(MDRV) σNS蛋白基因克隆序列测定结构与功能生物信息

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福建地方鸡B亚群禽白血病病毒的分离鉴定

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中国兽医科学 2016年第6期46卷 769-774页

作者：赵金荣曾宇坤朱二鹏周五朵吴异健胡万荣吴宝成吴晓平福建农林大学动物科学学院福建福州350002

在对福建某地方鸡群进行禽白血病流行病学调查的基础上,对疑似病例进行p27抗原检测,取阳性血清接种DF-1细胞分离病毒。采用PCR及间接免疫荧光试验鉴定其亚群并对其gp85基因进行序列分析。结果显示,分离株FJ15HT0的B亚群特异性PCR检测呈... 详细信息

在对福建某地方鸡群进行禽白血病流行病学调查的基础上,对疑似病例进行p27抗原检测,取阳性血清接种DF-1细胞分离病毒。采用PCR及间接免疫荧光试验鉴定其亚群并对其gp85基因进行序列分析。结果显示,分离株FJ15HT0的B亚群特异性PCR检测呈阳性;IFA显示感染该毒株的DF1细胞中可检测到p27抗原,而未检测到J亚群特异性囊膜蛋白的表达;对该毒株gp85序列进行分析,发现与多株ALV-B参考毒株氨基酸序列的同源性为91.6%～98.8%,其中与GX10LS01株同源性最高为98.8%,与A、C、D、E亚群同源性在69.4%～84.2%,与J亚群同源性仅为36%～38%。该研究首次分离并鉴定河田鸡群中ALV-B,为后续的研究奠定了基础。

关键词：地方鸡群 B亚群ALV 分离鉴定

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日粮纤维水平对梅山猪生长性能、纤维表观消化率及肠道微生物区系的影响

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中国畜牧杂志 2021年第S1期57卷 262-267页

作者：蒲广侯黎明刘根盛李平会许会英牛培培俞俊周五朵李平华黄瑞华南京农业大学养猪研究所江苏南京210095 南京农业大学淮安研究院江苏淮安223001 江苏省昆山市梅山猪保种场江苏昆山215000 江苏现代农业(生猪)产业技术体系集成创新中心江苏南京210095 淮安沐林新农村发展研究有限公司江苏淮安223001

试验旨在研究日粮纤维水平对梅山猪生长性能、纤维表观消化率及肠道微生物区系的影响。选用54头体重(31.24±0.59)kg的健康梅山育肥阉公猪,随机分为基础日粮组、7%麸皮替代组(麸皮替代7%基础日粮)、14%麸皮替代组(麸皮替代14%基础日粮)... 详细信息

试验旨在研究日粮纤维水平对梅山猪生长性能、纤维表观消化率及肠道微生物区系的影响。选用54头体重(31.24±0.59)kg的健康梅山育肥阉公猪,随机分为基础日粮组、7%麸皮替代组(麸皮替代7%基础日粮)、14%麸皮替代组(麸皮替代14%基础日粮),每组6个重复(即每栏),每栏3头猪。预试期7 d,正试期28 d。结果表明:14%麸皮替代组梅山猪终末体重、平均日采食量以及粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的表观全肠道消化率低于对照组(P<0.050),而7%麸皮替代组与基础日粮组无显著差异;随麸皮替代水平的升高,梅山猪粪便微生物丰度下降(Chao和Ace,线性P<0.05;Sobs,线性P<0.10),并且14%麸皮替代组的Unclassified_c__Clostridia、UCG-008、UCG-009、Fibrobacter、Cellul osilyticum、Lachnospiraceae_XPB1014_group、Papillibacter、Bacteroides、dgA-11_gut_group、norank_f__norank_o__Bradymonadales、norank_f__norank_o__WCHB1-41、norank_f__p-251-o5、norank_f__norank_o__norank_c__norank_p__WPS-2、norank_f__p-2534-18B5_gut_group和Akkermansia的相对丰度低于基础日粮组(P<0.050)。综上所述,用7%麸皮替代基础日粮时,梅山猪对粗蛋白质、能量的表观消化率显著降低,但其生长性能、各类纤维消化表观率以及肠道微生物区系未受到显著影响。因此,在梅山育肥猪饲养中用7%麸皮替代基础日粮是可行的。

关键词：梅山猪生长性能表观全肠道消化率微生物多样性纤维水平麸皮

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利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用

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畜牧兽医学报 2016年第4期47卷 762-770页

作者：余深翼赵金荣郑玲红朱二鹏周五朵吴宝成福建农林大学动物科学学院预防兽医实验室福州350002

旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统,并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异。首先构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9载体;随后人工设计同源修复供体基因序列,并亚克隆到CRISPR/Cas 9载体中,... 详细信息

旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统,并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异。首先构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9载体;随后人工设计同源修复供体基因序列,并亚克隆到CRISPR/Cas 9载体中,构建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除体系;将该系统分别应用到大肠杆菌DH10B、DH5α和JM109细胞中,PCR鉴定筛选到的阳性菌株,并回收其扩增条带进行克隆、测序。CRISPR/Cas 9载体的酶切与测序结果均正确,表明载体构建成功;PCR鉴定结果显示,该系统对三种大肠杆菌均能进行aroA基因的有效敲除,敲除效率为46%~58%;测序结果进一步证实目的基因敲除成功。本试验成功构建大肠杆菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系统,为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。

关键词： CRISPR/Cas 9系统大肠杆菌 aroA基因敲除同源修复

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猴头菇多糖对MDRV感染番鸭血清中细胞因子及激素水平的影响

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中国兽医科学 2017年第2期47卷 249-256页

作者：郑玲红吴异健廖加磊蔡栋灵张英扬朱二鹏周五朵吴宝成黄一帆福建农林大学动物科学学院福建福州350002 福建省兽医中药与动物保健重点实验室福建福州350002

为研究猴头菇多糖(HPS)对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染番鸭血清中的细胞因子及激素的影响,以探讨HPS对MDRV感染雏番鸭所致免疫抑制免疫调节作用。本试验借助已建立的MDRV自然感染模型进行HPS防治MDRV感染的试验,采用放射免疫测定方法检测... 详细信息

为研究猴头菇多糖(HPS)对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染番鸭血清中的细胞因子及激素的影响,以探讨HPS对MDRV感染雏番鸭所致免疫抑制免疫调节作用。本试验借助已建立的MDRV自然感染模型进行HPS防治MDRV感染的试验,采用放射免疫测定方法检测试验番鸭血清中部分细胞因子和激素含量的动态变化。结果显示,MDRV感染能抑制番鸭机体分泌IL-1、IL-2、IL-4、生长激素(GH)、促肾上腺皮质激素(ACTH),在感染中后期促进试验番鸭机体分泌糖皮质激素(GC),引起免疫应答下降或停止;HPS预防用药可以促进MDRV感染番鸭分泌IL-1、IL-2和IL-4;维持ACTH含量的相对稳定,抑制MDRV感染番鸭GC含量的急剧升高,促进GH的分泌,调节神经-内分泌-免疫系统。研究表明,HPS预防用药可通过调节MDRV感染番鸭部分细胞因子和激素的分泌量,参与机体免疫调节的过程,缓解MDRV感染番鸭的临床症状及病理变化,降低死亡率,促进免疫抑制番鸭的康复,为HPS在临床上防治MDRV的研究提供理论依据。

关键词：番鸭呼肠孤病毒猴头菇多糖细胞因子激素

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