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源于Halomonas sp.抗草甘膦EPSPS的克隆、鉴定及应用

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华中农业大学学报 2024年第3期43卷 158-166页

作者：丁宁何云浩吴琳绯李婵娟吴高兵华中农业大学植物科学技术学院武汉430070 武汉设计工程学院食品与生物科技学院武汉430205 华中农业大学生命科学技术学院武汉430070

为培育高抗草甘膦作物以应对草甘膦杂草进化,从海洋细菌中筛选到1株高抗草甘膦的盐单胞菌属菌株(Halomonassp.),通过基因组测序及生物信息学分析,确定该菌株的EPSPS基因,在Escherichiacoli(DE3)中对fHoEPSPS、mfHoEPSPS(G384A位点突变)... 详细信息

为培育高抗草甘膦作物以应对草甘膦杂草进化,从海洋细菌中筛选到1株高抗草甘膦的盐单胞菌属菌株(Halomonassp.),通过基因组测序及生物信息学分析,确定该菌株的EPSPS基因,在Escherichiacoli(DE3)中对fHoEPSPS、mfHoEPSPS(G384A位点突变)和mHoEPSPS(mfHoEPSPS N端缺失PDT)进行重组表达和纯化,并运用自切割肽LP4/2A介导的基因聚合策略,将抗草铵膦的酶(Repat)置于mHoEPSPS的N端,构建了双抗草甘/铵膦酶(RLH),将其编码基因导入烟草后赋予草甘/铵膦复合抗性。结果显示,该菌株的EPSPS基因(fHoEPSPS)可编码一个N段融合了预苯酸脱水酶(PDT)的双功能酶。草甘膦抗性分析显示mfHoEPSPS的抗性比fHoEPSPS提高了19倍,将mHoEPSPS基因导入烟草后可赋予烟草3倍推荐剂量的草甘膦耐受性,转RLH基因的烟草能够耐受3~5倍推荐剂量的草甘/铵膦复合除草剂。结果表明,源于Halomonas sp.的抗草甘膦EPSPS是一种新型草甘膦耐受酶,通过G384A的位点突变可提高酶活;利用自切割肽介导的基因堆叠策略获得的转RLH基因烟草表现出较高草甘/铵膦复合抗性。

关键词：抗除草剂作物抗草甘膦5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合成酶草铵膦乙酰转移酶双抗除草剂作物基因聚合

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Hotspot突变介导的油菜EPSPS草甘膦抗性改造与功能验证

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农业生物技术学报 2023年第5期31卷 889-900页

作者：柯达何云浩吴方曾玉兰华雨戴成吴高兵华中农业大学植物科学技术学院

草甘膦通过抑制植物5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS)，无选择性地杀死绝大多数草本植物。通过转基因策略，将对草甘膦具有抗性的EPSPS酶编码基因转入作物，可培育耐草甘膦的作... 详细信息

草甘膦通过抑制植物5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS)，无选择性地杀死绝大多数草本植物。通过转基因策略，将对草甘膦具有抗性的EPSPS酶编码基因转入作物，可培育耐草甘膦的作物。当前商业应用的抗草甘膦EPSPS主要来源于微生物，这种“跨界”的基因转移更容易引发人们对转基因安全的顾虑。因此，改造作物自身的EPSPS酶，进而利用内源基因培育耐除草剂作物，具有较大的应用价值。本研究通过构建甘蓝型油菜(Brassica napus) EPSPS突变热点(Hotspot)小型突变体文库，进而筛选高抗草甘膦的突变体。结果显示，获得了5个对除草剂抗性提高的突变体，其中突变体mBnEPSPS表现出最高的草甘膦抗性。相对于野生型BnEPSPS，突变体催化常数kcat由515/s下降到257/s，酶活下降了50%。草甘膦抑制动力学分析表明，存在草甘膦时，mBnEPSPS与BnEPSPS转换数kcat(gly)分别为116/s和13/s，突变体对草甘膦的抗性提高了8.9倍。酶学性质分析表明突变基本不改变酶对植物细胞微环境的适应性。mBnEPSPS转入烟草(Nicotiana benthamiana)后，能够使烟草耐受5倍于商业推荐剂量的农达(41%草甘膦异丙胺盐)处理，这一结果表明mBnEPSPS具有较高的育种应用价值。本研究为通过转基因和基因编辑培育抗除草剂油菜提供了基因资源和理论指导。

关键词：甘蓝型油菜草甘膦抗除草剂定向进化 5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)

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湖北邮政供应链管理现状及优化研究

湖北邮政供应链管理现状及优化研究

作者：吴高兵华中科技大学

学位级别：硕士

随着全球一体化的深入影响,世界各地的企业都被卷入全球竞争中来,全球化趋势加大了企业之间的竞争,供应链日益成为企业经营活动中的竞争模式的主流,供应链管理思想的发展为企业应对挑战和竞争提供了新的思路,供应链管理已经成为当今企... 详细信息

随着全球一体化的深入影响,世界各地的企业都被卷入全球竞争中来,全球化趋势加大了企业之间的竞争,供应链日益成为企业经营活动中的竞争模式的主流,供应链管理思想的发展为企业应对挑战和竞争提供了新的思路,供应链管理已经成为当今企业应对挑战与机遇的热门话题。湖北邮政虽然拥有完善的服务网络,良好的信誉以及得天独厚的政策支持,但是在现代物流竞争格局中,湖北邮政面临国内外物流巨头的强力竞争,湖北邮政靠着发达网络形成的供应链一直处于低效运作状态。对于湖北邮政这样一个对供应链依赖性很强的企业来说,这样的现状极其不利于企业的发展。本文以供应链管理思想为依托,将供应链分为服务型供应链和产品型供应链,湖北邮政供应链属于服务型供应链。针对服务型供应链,结合湖北邮政的具体现状,对湖北邮政的供应链现状进行了一些初步的探讨。文章首先对湖北邮政目前所处的环境、时代背景等都作了简要分析,对供应链管理理论作了简要介绍,在此基础上,对湖北邮政供应链现状及存在问题作了分析,接着,对湖北邮政的供应链优化措施提出自己的解决方法,并对优化后的供应链运行机制作了简要论述。希望能够把供应链管理理论和湖北邮政的管理有效的结合起来,为湖北邮政的发展寻找一种有效的管理模式。

关键词：湖北邮政供应链管理优化

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列车控制系统的抗拒绝服务攻击弹性控制策略

控制理论与应用 2024年第2期41卷 311-320页

作者：高兵步兵北京交通大学轨道交通控制与安全国家重点实验室北京100044

当遭受拒绝服务(DoS)攻击时,分布式列车控制系统的弹性控制问题受到广泛关注.本文提出了一种基于分布式领导车状态观测器和障碍李雅普诺夫函数的弹性控制策略,不仅可以避免列车碰撞,同时实现了编队控制的目标.首先,给出了一种分布式的... 详细信息

当遭受拒绝服务(DoS)攻击时,分布式列车控制系统的弹性控制问题受到广泛关注.本文提出了一种基于分布式领导车状态观测器和障碍李雅普诺夫函数的弹性控制策略,不仅可以避免列车碰撞,同时实现了编队控制的目标.首先,给出了一种分布式的领导车状态观测器设计方法,用于实时估计领导车的状态.理论分析表明,在DoS攻击满足一定约束的条件下,该状态观测器的估计误差具有指数稳定特性.在此基础上,通过将列车碰撞避免问题转化为状态受限问题,提出一种基于障碍李雅普诺夫函数的状态受限控制律,解决了DoS攻击下确保碰撞避免的车队控制问题.最后,数值仿真证实了本文方法的有效性.

关键词：拒绝服务弹性控制状态估计障碍李雅普诺夫函数列车运行控制碰撞避免

炭疽芽孢杆菌致死因子突变株K518E和L519C的筛选及活性分析

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生物化学与生物物理进展 2009年第10期36卷 1306-1312页

作者：封纯芳吴高兵曹莎刘子铎洪玉枝华中农业大学农业微生物国家重点实验室武汉430070 华中农业大学植物科学与技术学院武汉430070

为研究炭疽毒素致死因子(lethalfactor,LF)致死机理,更有效地防治炭疽,对LF基因1550～2324bp之间的片段进行了随机突变实验.通过细胞毒性实验筛选LF突变体库,结果获得5株活性降低突变体.进一步对单点突变体蛋白进行亲和纯化,首次得到了K... 详细信息

为研究炭疽毒素致死因子(lethalfactor,LF)致死机理,更有效地防治炭疽,对LF基因1550～2324bp之间的片段进行了随机突变实验.通过细胞毒性实验筛选LF突变体库,结果获得5株活性降低突变体.进一步对单点突变体蛋白进行亲和纯化,首次得到了K518E、L519C两种突变蛋白,对其进行纯蛋白活性检测和竞争抑制实验,发现这两种突变蛋白活性显著降低,表明518位赖氨酸和519位亮氨酸对LF功能起着非常重要的作用.并且发现,K518E对野生型LF具有一定的抑制作用,对LF作用机理的研究有一定帮助.

关键词：炭疽致死因子随机突变细胞毒性实验

抗草铵膦除草剂转基因油菜新种质的创制及鉴定

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植物遗传资源学报 2022年第6期23卷 1696-1708页

作者：吴潞梅覃萍闫彤端群于洋柳寒林拥军吴高兵范楚川周永明湖北洪山实验室武汉430070 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室武汉430070 华中农业大学植物科学技术学院武汉430070

草铵膦是一种在世界范围内广泛使用的内吸型除草剂。目前,我国还未研发出具有自主知识产权的抗草铵膦除草剂油菜品种。本研究通过油菜下胚轴遗传转化方法成功将1个新型草铵膦抗性基因Syn1-RePAT转化到甘蓝型油菜中,通过筛选获得了27株... 详细信息

草铵膦是一种在世界范围内广泛使用的内吸型除草剂。目前,我国还未研发出具有自主知识产权的抗草铵膦除草剂油菜品种。本研究通过油菜下胚轴遗传转化方法成功将1个新型草铵膦抗性基因Syn1-RePAT转化到甘蓝型油菜中,通过筛选获得了27株阳性单株。利用Southern blot技术筛选出其中的单拷贝T-DNA插入株系,并通过后代分离比检测对重要株系进行了拷贝数验证。利用Inverse-PCR技术对OV40-7、OV40-15、OV40-16和OV40-17等转化体进行T-DNA侧翼序列分析与比对,分离获得了各转基因株系的插入位点信息。对不同转化体株系设计特异性引物,通过PCR技术检测外源基因序列在T1~T3代材料的整合稳定性。RT-PCR和qRT-PCR表达分析证实,Syn1-RePAT转基因在多个转化株系的不同世代稳定超量表达。对T1代转化体进行功能鉴定,各转化体对草铵膦具有良好的抗性,至少可耐受6倍田间推荐施用剂量的草铵膦。本研究所创建的新型抗草铵膦油菜种质资源极具应用前景,为我国抗草铵膦良种培育工作提供了有力支持。

关键词：甘蓝型油菜 Syn1-RePAT 转基因油菜草铵膦分子特征

炭疽水肿因子在大肠杆菌中高效表达及一步法纯化

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微生物学报 2016年第7期56卷 1141-1148页

作者：李婵娟张向楠张绍伟吴高兵农业微生物学国家重点实验室华中农业大学植物科学技术学院湖北武汉430070 武汉设计工程学院湖北武汉430205 华中农业大学生命科学技术学院湖北武汉430070

【目的】本研究旨在建立一种简单快捷的炭疽水肿因子(EF)重组表达及纯化方法。【方法】构建GST-EF融合表达载体,基于EF基因的密码子使用偏好,选择菌株Escherichia coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIL为表达宿主,对EF进行诱导表达;细胞透性... 详细信息

【目的】本研究旨在建立一种简单快捷的炭疽水肿因子(EF)重组表达及纯化方法。【方法】构建GST-EF融合表达载体,基于EF基因的密码子使用偏好,选择菌株Escherichia coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIL为表达宿主,对EF进行诱导表达;细胞透性技术分离粗蛋白,进而利用亲和层析一步法纯化EF;Native-PAGE、竞争性抑制实验及c AMP浓度分析用于鉴定EF的生物活性。【结果】实现了EF可溶性高效表达,透性化处理可有效抽提可溶性重组蛋白;利用亲和层析一步法纯化得到了纯度达96%的EF;EF可与保护性抗原(PA)结合形成水肿毒素,该毒素能够急剧提高CHO-K1细胞中c AMP的浓度。【结论】本研究建立了一种高效快速制备具有生物活性的炭疽水肿因子的方法,为炭疽相关研究工作提供了新的选择。

关键词：炭疽水肿因子重组表达亲和层析

嗜水气单胞菌丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及酶学分析

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农业生物技术学报 2010年第4期18卷 783-787页

作者：黄飞吴高兵黄小罗洪玉枝农业微生物学国家重点实验室华中农业大学植物科学技术学院

以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)基因组DNA为模板,通过PCR方法首次克隆了该菌的丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA)。将该基因插入到表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,获得含有重组质粒pGEX-glyA的重组菌株。... 详细信息

以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)基因组DNA为模板,通过PCR方法首次克隆了该菌的丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA)。将该基因插入到表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,获得含有重组质粒pGEX-glyA的重组菌株。核苷酸序列测定表明该基因(GenBank登录号:FJ797607)全长1254bp,编码417个氨基酸。重组菌株IPTG诱导表达后,经过GST-tag亲和层析纯化,得到约45kD的目的蛋白。对纯化的丝氨酸羟甲基转移酶进行酶学性质分析表明,该酶的最适反应为pH8.0,最适反应温度为20℃,Cu2+和Mn2+对该酶有激活作用,而Zn2+和SDS对该酶有抑制作用。由于该酶的最适反应温度是20℃,使得它在工业上具有一定的应用价值,同时有助于对低温酶机制的研究。

关键词：丝氨酸羟甲基转移酶亲和层析嗜水气单胞菌

图书馆为专门适用主体之著作权合理使用条款国际比较及启示

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图书馆建设 2024年

作者：吴高广西师范大学图书馆广西师范大学法学院

通过调研英国、美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、德国、日本、法国、韩国等九个国家的最新著作权立法情况，对图书馆为专门适用主体之著作权合理使用条款进行了全方位比较分析。图书馆为专门适用主体的著作权合理使用例外主要包括基于... 详细信息

通过调研英国、美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、德国、日本、法国、韩国等九个国家的最新著作权立法情况，对图书馆为专门适用主体之著作权合理使用条款进行了全方位比较分析。图书馆为专门适用主体的著作权合理使用例外主要包括基于保存或替换、基于馆际互借、基于研究或学习等三个目的制作或提供复制件的合理使用。我国应借鉴国外立法经验，结合本国实际，在未来著作权法修订和配套法规制定过程中，不断优化图书馆著作权合理使用规则体系。

关键词：图书馆适用主体著作权合理使用国际比较