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HcNPV半胱氨酸蛋白酶、几丁质酶基因失活分析

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2000年第2期32卷 187-191页

作者：贡成良小林淳金伟吴祥甫中国科学院上海生物化学研究所!上海200031 苏州大学蚕桑学院基因工程实验室!苏州215151 日本三重大学工学部材料化学系!三重514 浙江大学蚕学系!杭州310029

将含有美国白蛾核型多角体病毒 (Hyphantriacuneanuclearpolyhedrosisvirus,HcNPV)半胱氨酸蛋白酶基因 (CP)的片段和几丁质酶基因 (ChiA)的片段克隆进PCRII,构建了转移载体pHcCVdel;将含有HcNPV多角体蛋白全基因 ( polh)序列的片段插入... 详细信息

将含有美国白蛾核型多角体病毒 (Hyphantriacuneanuclearpolyhedrosisvirus,HcNPV)半胱氨酸蛋白酶基因 (CP)的片段和几丁质酶基因 (ChiA)的片段克隆进PCRII,构建了转移载体pHcCVdel;将含有HcNPV多角体蛋白全基因 ( polh)序列的片段插入到 pHcCVdel的EcoRI位点 ,得到重组转移载体pHcCVpolh。通过该重组转移载体与含有家蚕促前胸激素基因 (PTTH)的重组病毒HcNPVPTTH+的DNA共转染SPIM细胞 ,使 polh基因取代ChiA基因起始密码下游 +76位到CP基因起始密码下游 +2 0位之间的区域 ,从而构建了CP、ChiA两基因同时失活的、能表达PTTH并能形成多角体的重组病毒HcNPVpolh+CP-ChiA-PTTH+。感染SPIM细胞表明 :CP、ChiA两基因为病毒复制非必需基因 ,它们的失活不影响病毒的复制与多角体的形成 ,但感染细胞的存活时间比HcNPV、HcNPVPTTH+感染的多 2天。推测CP、ChiA两基因失活后 ,可延长细胞持续表达外源基因的时间。

关键词：美国白蛾核型多角体病毒半胱氨酸蛋白酶几丁质酶基因失活

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β─半乳糖苷酶的表达

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病毒学报 1994年第3期10卷 251-256页

作者：张颖吴祥甫中国科学院上海生物化学研究所

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子，用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动子控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家... 详细信息

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子，用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动子控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶，表达量达到５８０μｇ／条蚕，从而证实我们构建的载体是可靠的、有效的，可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。

关键词：家蚕核型多角体病毒半乳糖苷酶

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大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

华东理工大学学报（自然科学版） 2002年第2期28卷 149-152页

作者：范立强袁勤生吴祥甫华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室生物化学研究所上海200237 中国科学院上海生物化学研究所上海200031

用聚合酶链反应 ( PCR)从大肠杆菌 K1 2 s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因 cai E,将其克隆到克隆载体 p Bluescript SK中 ,测序表明 :该基因有 61 2 bp,与文献报道相比 ,有 1 0个核苷酸不同 ,相应的翻译氨基酸有 6个相异。将该基因重... 详细信息

用聚合酶链反应 ( PCR)从大肠杆菌 K1 2 s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因 cai E,将其克隆到克隆载体 p Bluescript SK中 ,测序表明 :该基因有 61 2 bp,与文献报道相比 ,有 1 0个核苷酸不同 ,相应的翻译氨基酸有 6个相异。将该基因重组到 Col E1为复制子、T7为启动子控制下的分泌型表达载体 p ET- 2 2 b( + )中 ,构建表达质粒 p ETCai E;重组到载体 p ACYC1 84中构建以 p1 5 A为复制子、Lac为启动子的表达质粒 p ACYC- Cai E;重组到载体 p WSK1 2 9中 ,构建以 p SC1 0 1为复制子、T7为启动子的表达质粒 p SC- Cai E。上述表达质粒转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,经 1 mmol/L异丙基硫代 -β- D-半乳糖苷 ( IPTG)诱导后 ,均可表达。 SDS- PAGE分析表明表达蛋白分子质量约2 6ku,表达量占菌体总蛋白质的比例分别为 p ETCai E30 % ,p ACYC- Cai E8% ,p SC- Cai E5 %

关键词：肉碱表达载体基因克隆基因表达大肠杆菌

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双质粒系统共表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB及其辅酶合成基因caiE

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第1期34卷 104-108页

作者：范立强袁勤生吴祥甫中国科学院上海生物化学研究所上海200237 上海200031 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室、生物化学研究所

caiB基因和caiE基因分别编码肉碱脱水酶及其辅因子合成酶 ,两者的共表达可以获得高活性肉碱脱水酶的重组菌。分别用两相容性质粒和不相容质粒共表达肉碱脱水酶及其辅酶合成基因 ,并对两种方法进行了比较。经IPTG诱导 ,相容性双质粒系统... 详细信息

caiB基因和caiE基因分别编码肉碱脱水酶及其辅因子合成酶 ,两者的共表达可以获得高活性肉碱脱水酶的重组菌。分别用两相容性质粒和不相容质粒共表达肉碱脱水酶及其辅酶合成基因 ,并对两种方法进行了比较。经IPTG诱导 ,相容性双质粒系统中两基因表达量分别占菌体总蛋白质的 17%和 10 % ;不相容性双质粒系统中两基因表达量分别占菌体总蛋白质的 39%和 2 0 %。共转化菌的酶活力比pET2 8caiB单质粒转化菌均提高 2 .3倍左右。两种双质粒转化系统相似 ,都需在外界抗生素选择压力下保持质粒稳定性

关键词：肉碱共表达双质粒相容质粒不相容质粒

粮食生产仍是“上热下冷”——浅析粮食生产上存在的几个问题

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农村工作通讯 1996年第6期 40-41页

作者：吴祥甫

近年来,党中央三令五申,要重视农业,特别是粮食生产。省、市、县各级党和政府采取了许多措施,鼓励农民多种粮食,为国家作出贡献。在这样一个农业升温的大好形势下,粮食生产仍然是"上热下冷",好的政策落不到脚,抓粮食生产始终是个问题。... 详细信息

近年来,党中央三令五申,要重视农业,特别是粮食生产。省、市、县各级党和政府采取了许多措施,鼓励农民多种粮食,为国家作出贡献。在这样一个农业升温的大好形势下,粮食生产仍然是"上热下冷",好的政策落不到脚,抓粮食生产始终是个问题。笔者调查后认为,目前发展粮食生产还存在有以下几个问题,必须引起重视。

关键词：粮食农民农业劳动者上热下冷

家蚕核多角体病毒解旋酶基因启动子及增强子hr3功能分析

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2001年第5期33卷 525-530页

作者：肖庆利张志芳易咏竹何家禄吴祥甫农业部家蚕生物技术重点开放实验室、中国农业科学院蚕业研究所!镇江212018

从BmNPVZJ8株克隆了解旋酶 (helicase)基因ATG上游的 5 10bp启动子 ,序列分析发现 ,该启动子同时具有早期和晚期RNA转录起始位点。将起始密码突变为ATT后 ,引入萤火虫荧光素酶 (Luc)基因作瞬时表达分析。用表达质粒 pBmhel5 10luc转染B... 详细信息

从BmNPVZJ8株克隆了解旋酶 (helicase)基因ATG上游的 5 10bp启动子 ,序列分析发现 ,该启动子同时具有早期和晚期RNA转录起始位点。将起始密码突变为ATT后 ,引入萤火虫荧光素酶 (Luc)基因作瞬时表达分析。用表达质粒 pBmhel5 10luc转染Bm 5和Sf 2 1细胞 ,解旋酶基因启动子能被细胞的RNA聚合酶识别 ,具有早期启动子的特性 ,且病毒因子对hel5 10启动子具有反式激活作用。杆状病毒同源重复区 (hr)序列是病毒DNA复制起始点 ,又具有增强子功能。将BmNPVhr3序列克隆到hel5 10启动子的下游进行瞬时表达 ,结果表明 ,hr3可增强hel5 10启动子在昆虫细胞和家蚕幼虫中的转录活性分别达 70 0 0倍和 10 0 0倍左右

关键词：家蚕核多角体病毒解旋酶基因启动子增强子瞬时表达

乙肝病毒表面抗原抗体可变区基因的克隆及人－鼠嵌合抗体重链基因的表达

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1996年第3期28卷 257-264页

作者：陈亚华周铬吴祥甫余拥军中国科学院上海生物化学研究所中山医院肝癌研究所

本文采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，从鼠抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）单克隆细胞中克隆到了该抗体重、轻链可变区（Ⅴ区）基因，并分别将其与人的恒定区基因Ｃγ３，Ｃｋ相拼接，构建人－鼠嵌合抗体基因。ＳＤＳ... 详细信息

本文采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，从鼠抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）单克隆细胞中克隆到了该抗体重、轻链可变区（Ⅴ区）基因，并分别将其与人的恒定区基因Ｃγ３，Ｃｋ相拼接，构建人－鼠嵌合抗体基因。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析结果证实嵌合抗体重链基因在Ｅ．ｃｏｌｉ中得到了表达。间接ＥＬＩＳＡ法免疫测定的结果表明该表达产物具有与乙肝表面抗原结合的能力。

关键词：乙肝表面抗原抗体基因:嵌合抗体基因基因表达

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一位忠诚为民办实事的村支书

农村经济导刊 2003年第4期 48-49页

作者：吴祥甫临安市农办

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天目生猪合作社理事长鲍文华的其人其事

农村经济导刊 2003年第9期 45-46页

作者：吴祥甫临安市农办