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一株人源性轮状病毒的分离及适应性培养

中国生物工程杂志 2013年第4期33卷 9-14页

作者：李松张光明吴晋元尹娜易山米锴曹颖李杨孙茂盛李鸿钧中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南省重大传染病疫苗研发实验室昆明650118 昆明医科大学昆明650031

目的:研究轮状病毒野毒株的分离方法、组织培养适应条件及相应生物学性质。方法:对收集的样品采用胶体金、PCR、PAGE进行轮状病毒定性检测。阳性样品按常规方法处理并进行组织培养分离,对不同传代样品做基因组图谱、基因序列、病毒增殖... 详细信息

目的:研究轮状病毒野毒株的分离方法、组织培养适应条件及相应生物学性质。方法:对收集的样品采用胶体金、PCR、PAGE进行轮状病毒定性检测。阳性样品按常规方法处理并进行组织培养分离,对不同传代样品做基因组图谱、基因序列、病毒增殖动力学分析评价,采用轮状病毒P[8]G1型阳性血清进行病毒中和鉴别试验。结果:通过检测为A组轮状病毒,基因组为4∶2∶3∶2排列,基因分型G1P[8]型,在MA104细胞中传代后转至Vero细胞上适应培养可观察到CPE;电镜观察可见典型轮状病毒形态。毒株在Vero细胞上增殖到第10代,复制稳定,且感染性滴度达到7.25 log CCID50/ml,增殖高峰为96h。中和鉴别试验证实病毒培养液只包含轮状病毒,无其他病毒污染。结论:从腹泻样品中分离得到一株人源轮状病毒毒株,命名为ZTR-68株,该分离株具有良好的组织培养适应性,遗传稳定性,为进一步研究其生物学性质和疫苗制备提供了基础。

关键词：轮状病毒分离适应性培养 Vero细胞

腺病毒载体表达轮状病毒G1型外壳蛋白VP7及其诱导的免疫应答研究

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现代免疫学 2015年第2期35卷 96-101页

作者：谢力闫姗姗欧霞郭莉莉吴晋元周艳李鸿钧孙茂盛昆明学院医学院昆明650214 中国医学科学院医学生物学研究所、北京协和医学院、云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 昆明医科大学昆明650503

构建表达地方流行株轮状病毒G1型外壳蛋白VP7的复制缺陷型重组腺病毒,免疫小鼠评价其体液及细胞免疫反应效果,探讨基因工程轮状病毒疫苗的实验基础及可行性。RT-PCR扩增轮状病毒VP7基因并克隆至pshuttle-CMV穿梭质粒,pshuttle-VP7与腺... 详细信息

构建表达地方流行株轮状病毒G1型外壳蛋白VP7的复制缺陷型重组腺病毒,免疫小鼠评价其体液及细胞免疫反应效果,探讨基因工程轮状病毒疫苗的实验基础及可行性。RT-PCR扩增轮状病毒VP7基因并克隆至pshuttle-CMV穿梭质粒,pshuttle-VP7与腺病毒骨架质粒同源重组后转染293细胞包装重组腺病毒rAd-VP7。RT-PCR、western blot检测rAdVP7在体外细胞中的转录及表达。rAd-VP7经肌注或滴鼻免疫小鼠后检测其血清IgG、肠道IgA及中和抗体效价;流式、ELISPOT检测淋巴细胞亚群变化及IFN-γ分泌情况。结果显示ELISA可检测到免疫小鼠血清IgG和滴鼻组肠道IgA抗体的产生;肌注和滴鼻免疫组中和抗体平均滴度分别为228和322.5;免疫小鼠脾细胞IFN-γ的分泌增加。表达轮状病毒VP7的重组腺病毒不但能够激发体液及细胞免疫反应,滴鼻免疫途径还可诱导粘膜免疫应答。

关键词：轮状病毒 VP7 重组腺病毒免疫原性

灭活轮状病毒疫苗与灭活脊髓灰质炎病毒疫苗联合使用免疫效果评价

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中国生物制品学杂志 2015年第3期28卷 217-222页

作者：牛香莲张光明吴晋元米鍇谢力孙晓琴李鸿钧孙茂盛中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所分子生物学研究室云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的评价灭活轮状病毒疫苗(inactivated rotavirus vaccine,IRV)与灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(inactivated poliovirus vaccine,IPV)免疫大鼠后,两种疫苗间免疫效果的相互作用。方法将Wistar大鼠随机分成联合免疫组、间隔免疫组和单疫苗免... 详细信息

目的评价灭活轮状病毒疫苗(inactivated rotavirus vaccine,IRV)与灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(inactivated poliovirus vaccine,IPV)免疫大鼠后,两种疫苗间免疫效果的相互作用。方法将Wistar大鼠随机分成联合免疫组、间隔免疫组和单疫苗免疫组:联合免疫组接种IPV后4周,经双侧腿同时免疫IPV和IRV,共2次,间隔4周;单疫苗免疫组2组,分别免疫3针IPV和2针IRV,每针均间隔4周;间隔免疫组免疫1针IPV后4周,开始进行IPV和IRV间隔免疫(每针间隔2周,共6周)。分别于每次免疫后4周经尾静脉采血,分离血清,采用微量中和试验结合免疫荧光抑制方法检测血清抗RV中和抗体水平,ELISA法检测血清抗RV特异性Ig G抗体水平,微量中和试验法检测血清抗脊髓灰质炎病毒中和抗体水平。结果大鼠经2针IRV免疫后,血清抗RV中和抗体和特异性Ig G抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)均明显上升,血清抗体阳转率均达100%;经3针IPV免疫后,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体GMT均明显上升,抗体阳转率均达100%;联合免疫组、间隔免疫组和单疫苗免疫组间血清抗RV中和抗体水平、特异性Ig G抗体水平及抗脊髓灰质炎病毒中和抗体水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IRV和IPV免疫大鼠后均获得到良好的免疫效果,两种疫苗联合使用时,免疫效果无相互干扰作用。

关键词：灭活轮状病毒疫苗灭活脊髓灰质炎疫苗联合免疫

人轮状病毒ZTR-5株灭活疫苗的制备及小鼠血清免疫学评价

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中国生物工程杂志 2011年第11期31卷 6-10页

作者：贾琴妹吴晋元易山张光明郜岩杨星赵晓南孙茂盛李鸿钧中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 昆明医学院昆明650031

目的:研究人轮状病毒ZTR-5株灭活疫苗的制备及在实验小鼠中的免疫原性评价。方法:轮状病毒ZTR-5株在MA104细胞上经蚀斑筛选纯化后,获得单一克隆接种至Vero细胞上适应性培养,免疫荧光定量检测病毒的感染性滴度,对收获的病毒液进行离心、... 详细信息

目的:研究人轮状病毒ZTR-5株灭活疫苗的制备及在实验小鼠中的免疫原性评价。方法:轮状病毒ZTR-5株在MA104细胞上经蚀斑筛选纯化后,获得单一克隆接种至Vero细胞上适应性培养,免疫荧光定量检测病毒的感染性滴度,对收获的病毒液进行离心、超滤、分子筛纯化,甲醛灭活,抗原定量检测Al(OH)3吸附制备的实验性疫苗。使用不同剂量(8EU、32EU、128EU、256EU)经肌内注射免疫小鼠,共免疫三次,免疫间隔2周。采用间接ELISA法检测血清特异性抗体效价。结果:通过蚀斑纯化,筛选得到一株纯化的病毒株ZTR-5纯-1,在Vero细胞上适应性后感染性滴度达7.35logCCID50/ml;大量培养收获的病毒原液滴度为7.57logCCID50/ml,制备获得轮状病毒样品抗原含量为2 560EU/ml;经肌内注射,初次免疫后,所有剂量组动物均获得抗体阳转,阳转率为100%;第一次加强免疫后,各组血清特异性抗体水平均明显增高,免疫剂量为128EU和256EU的两组小鼠血清抗体效价均达1∶10 240;第二次加强免疫后,各剂量组(8EU、32EU、128EU、256EU)血清抗体效价依次达1∶5 120,1∶7 456,1∶14 481.54,1∶14 481.54。结论:人轮状病毒ZTR-5株可在Vero细胞上稳定增殖,所制备的疫苗具良好免疫原性,用128EU/2次免疫即可获得良好的免疫效果。

关键词：人轮状病毒 Vero细胞灭活疫苗免疫试验

靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白shRNA慢病毒干扰质粒的构建及鉴定

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中国生物制品学杂志 2016年第1期29卷 7-12页

作者：周艳解裕萍吴晋元闫姗姗张磊李鸿钧中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的构建靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein,PTB)的shRNA慢病毒干扰质粒,并对其进行鉴定。方法根据Gen Bank中登录的PTB的基因序列设计并合成2条靶向MA104细胞PTB基因的shRNA干扰序列(shPTB1、sh... 详细信息

目的构建靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein,PTB)的shRNA慢病毒干扰质粒,并对其进行鉴定。方法根据Gen Bank中登录的PTB的基因序列设计并合成2条靶向MA104细胞PTB基因的shRNA干扰序列(shPTB1、shPTB2)和1条阴性对照序列(shControl),分别插入载体p LVshRNA-EGFP(2A)Puro后,构建慢病毒重组质粒;利用HEK293Ta细胞包装针对PTB基因的shRNA的重组慢病毒颗粒;感染MA104细胞后,经Resl-time PCR、免疫荧光和Western blot法分别检测MA104细胞中PTB基因的转录和蛋白表达水平。结果 PCR及测序鉴定证明3种重组慢病毒质粒构建正确。3种重组慢病毒质粒转染HEK293Ta细胞48 h后,均可见绿色荧光表达,3组细胞的病毒滴度均为2×106 TU/ml。3种重组慢病毒感染MA104细胞48 h后均可见绿色荧光表达。经嘌呤霉素加压筛选后,p LVshPTB1-EGFP-2A和p LVshPTB2-EGFP-2A组MA104细胞仅有少量细胞于细胞核中表达,p LVshPTB1-EGFP-2A组MA104细胞中PTB基因转录及蛋白表达的水平均低于p LVshPTB2-EGFP-2A组。结论成功构建了靶向MA104细胞PTB蛋白的shRNA重组慢病毒,shRNA序列可成功下调PTB在MA104细胞中的表达,为PTB在RV增殖过程中调控作用的研究奠定了基础。

关键词： MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白慢病毒质粒 RNA干扰

EGFP和LmxlA双基因共表达重组腺病毒的构建及检测

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中国生物工程杂志 2014年第9期34卷 72-79页

作者：周艳王小囡闫姗姗吴晋元孙茂盛张磊李鸿钧中国医学科学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的:通过携带绿色荧光蛋白(EGFP)和转录因子Lmx1A(LIM homeobox transcription factor1-alpha)的双顺反子重组腺病毒的构建和包装,评价双顺反子构建方法的可行性,为进一步探讨转录因子Lmx1A在间充质干细胞分化为神经元细胞的潜能提供... 详细信息

目的:通过携带绿色荧光蛋白(EGFP)和转录因子Lmx1A(LIM homeobox transcription factor1-alpha)的双顺反子重组腺病毒的构建和包装,评价双顺反子构建方法的可行性,为进一步探讨转录因子Lmx1A在间充质干细胞分化为神经元细胞的潜能提供实验基础。方法:通过PCR方法获得增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和转录因子Lmx1A的CDS区序列,将其构建到双顺反子表达质粒pcDNA3.0BA,通过PCR的方法获得双顺反子表达盒,并插入到腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV中,经过与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,获得阳性重组质粒pAd-EGFP-Lmx1A,并进一步在HEK293细胞中包装为腺病毒。用携带EGFP和Lmx1A基因的重组腺病毒感染人脐带间充质干细(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs),通过RT-PCR、免疫荧光及Western blot的方法检测EGFP和Lmx1A的表达及产物定位。结果:透射电镜检查包装好的重组腺病毒为典型的腺病毒颗粒形态,大小约为75nm。Ad-EGFP-Lmx1A感染hUC-MSCs后检测到EGFP和Lmx1A的转录产物,表达产物互不影响,表达强弱无明显差异。结论:利用双顺反子真核表达质粒pcDNA3.0BA能够构建同时表达两个基因的重组腺病毒,腺病毒感染细胞后能够将两个基因传递至间充质干细胞中并表达。通过EGFP的观察可对腺病毒的表达效率进行实时观察,这些研究结果为任意组合的双基因表达建立了快速有效的构建方法,重组腺病毒Ad-EGFPLmx1A的成功构建也为将来研究Lmx1A在间充质干细胞分化为神经元过程中的作用提供了实验基础。

关键词：增强型绿色荧光蛋白 Lmx1A 重组腺病毒双顺反子

被动免疫轮状病毒NSP4&VP7双抗原重组腺病毒对感染乳鼠的排毒保护作用

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病毒学报 2021年第6期37卷 1341-1347页

作者：谢力曾韦锟贾静句红萍唐丽媛秦林才吴晋元李鸿钧孙茂盛昆明学院医学院昆明650214 中国医学科学院医学生物学研究所北京协和医学院云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650214

为建立小鼠轮状病毒(Rotavirus,RV)感染动物模型,研究可同时表达轮状病毒NSP4(Nonstructural protein4)和VP7(Viral protein 7)的重组腺病毒疫苗免疫孕鼠后对新生乳鼠感染RV的被动保护作用。新生乳鼠口服异源株轮状病毒Wa、ZTR-68或SA1... 详细信息

为建立小鼠轮状病毒(Rotavirus,RV)感染动物模型,研究可同时表达轮状病毒NSP4(Nonstructural protein4)和VP7(Viral protein 7)的重组腺病毒疫苗免疫孕鼠后对新生乳鼠感染RV的被动保护作用。新生乳鼠口服异源株轮状病毒Wa、ZTR-68或SA11株后(分2次给予,每次含5×10^(4)CCID_(50)的RV),观察乳鼠是否有腹泻症状、肠道病理变化,检测乳鼠粪便排毒百分率;另以重组腺病毒rAd-NSP4-VP7免疫孕鼠后,检测母鼠血清抗体产生情况,并对比乳鼠粪便中RV抗原检出率初步评价疫苗的被动免疫保护作用。发现口服异源株RV的乳鼠未出现类似人类婴幼儿感染后的明显腹泻症状,但在粪便中可检测到RV抗原的存在(Wa、ZTR-68攻毒组均超过80%)。经rAd-NSP4-VP7被动免疫的乳鼠接受Wa和ZTR-68攻毒后其粪便中的RV检出率比未受到被动免疫保护的对照组降低(P<0.05)。rAd-NSP4-VP7重组腺病毒免疫母鼠可显示出对孕鼠感染RV的被动免疫保护作用。

关键词：轮状病毒(RV) NSP4 VP7 重组腺病毒乳鼠被动免疫

云南江城和黑井盐矿沉积物未培养放线菌多样性比较

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云南江城和黑井盐矿沉积物未培养放线菌多样性比较

2008年中国微生物学会学术年会

作者：吴晋元唐蜀昆职晓阳徐丽华李文均云南大学云南省微生物研究所教育部微生物多样性可持续利用重点实验室

高盐环境中存在着丰富的微生物资源,研究人员通过分子生物技术及纯培养分离技术,不断认识高盐极端环境中的细菌和嗜盐古菌类群的多样性。目前由于放线菌资源的广泛应用,高盐环境中的放线菌资源调查和应用日益得到重视。围绕云南江城和...

高盐环境中存在着丰富的微生物资源,研究人员通过分子生物技术及纯培养分离技术,不断认识高盐极端环境中的细菌和嗜盐古菌类群的多样性。目前由于放线菌资源的广泛应用,高盐环境中的放线菌资源调查和应用日益得到重视。围绕云南江城和黑井两个地区的3个盐矿样点沉积物中放线菌的多样性和群落组成,我们通过放线菌特异性引物对总DNA进行16S rRNA基因扩增,经过克隆文库构建,利用酶切并选择其中不同带型的133个克隆的16S

关键词：

来源： cnki会议评论

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秋冬季婴幼儿轮状病毒感染分子流行病学调查

中国公共卫生 2012年第6期28卷 823-825页

作者：赵晓南李鸿钧吴晋元张光明易山杨星郜岩贾琴妹木国法孙茂盛北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明医学院云南省昭通市第一人民医院

目的监测2010年云南昭通地区秋冬季腹泻患儿感染轮状病毒的流行趋势,了解流行毒株的基因型特征。方法 2010年9—12月在云南省昭通市第一人民医院采集94份就诊的腹泻患儿粪便,应用胶体金法、逆转录聚合酶链式反应及PAGE电泳等方法,对样... 详细信息

目的监测2010年云南昭通地区秋冬季腹泻患儿感染轮状病毒的流行趋势,了解流行毒株的基因型特征。方法 2010年9—12月在云南省昭通市第一人民医院采集94份就诊的腹泻患儿粪便,应用胶体金法、逆转录聚合酶链式反应及PAGE电泳等方法,对样品进行轮状病毒抗原检测,其中8份阳性样品进行VP7基因测序分析及基因型分型。结果腹泻病患排泄物中轮状病毒抗原阳性比例为54.3%(51/94);8份轮状病毒基因序列分析,其中7份为G1型,1份为G3型;核苷酸同源性分析发现检测样品中轮状病毒主要与在中国辽宁、印度和泰国发现的流行株相似。结论 2010年昭通地区秋冬季患儿腹泻主要由轮状病毒引起,其中以G1型为主,其次为G3型。

关键词：轮状病毒婴幼儿腹泻基因型