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nptⅡ基因真菌表达载体的构建及在苹果炭疽叶枯病菌遗传转化中的应用

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基因组学与应用生物学 2015年第10期34卷 2156-2160页

作者：吴建圆冀志蕊李壮程存刚周宗山张俊祥中国农业科学院果树研究所兴城125100

本研究旨在构建1个适用于苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingulata)的遗传转化载体,为系统研究该病原菌基因的功能提供便利。通过基因工程及分子生物学技术,将三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因启动子Pgap和新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)连... 详细信息

本研究旨在构建1个适用于苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingulata)的遗传转化载体,为系统研究该病原菌基因的功能提供便利。通过基因工程及分子生物学技术,将三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因启动子Pgap和新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)连结于质粒p Cambia0380中。构建的载体p Gapneo R1导入根癌农杆菌LBA4404后,通过农杆菌介导的转化技术(ATMT),成功将nptⅡ基因盒整合到苹果炭疽叶枯病菌基因组中。Southern blot分析结果表明,随机挑取的转化子T-DNA均以单拷贝插入到苹果炭疽叶枯病菌基因组中,表明该载体适合于苹果炭疽叶枯病菌的遗传转化。此外,该载体也可用于构建苹果炭疽叶枯病菌的目标基因的回补载体、超表达载体和荧光融合蛋白表达载体。

关键词：炭疽病新霉素磷酸转移酶基因农杆菌启动子

苹果炭疽叶枯病菌致病力分析及苹果种质抗病性鉴定

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植物遗传资源学报 2017年第2期18卷 210-216页

作者：吴建圆王娜冀志蕊迟福梅周宗山张俊祥中国农业科学院果树研究所辽宁兴城125100

苹果炭疽叶枯病是由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的一种真菌病害,现已上升为世界苹果生产中的主要病害之一。了解不同来源的苹果炭疽叶枯病菌致病力差异及明确苹果种质资源对苹果炭疽叶枯病的抗性,对品种选育、品种... 详细信息

苹果炭疽叶枯病是由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的一种真菌病害,现已上升为世界苹果生产中的主要病害之一。了解不同来源的苹果炭疽叶枯病菌致病力差异及明确苹果种质资源对苹果炭疽叶枯病的抗性,对品种选育、品种合理布局以及控制病害的流行具有重要的参考价值。本研究对不同来源的79株病原菌进行了室内致病力测定,获知该菌致病力差异明显,其中强致病力菌株所占比例大。同时,本研究也对327份苹果种质资源进行了室内抗病性鉴定,其中高抗资源160份,中抗资源6份,中感资源22份,高感资源139份。表明我国现保存的苹果种质资源中存在丰富抗病种质。进一步按苹果分类系统分析发现,抗病资源在当前栽培的主要品种群中均有分布,特别是红玉品种群、富士品种群抗病资源最为丰富。

关键词：苹果炭疽叶枯病胶胞炭疽菌致病力抗病资源

苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因eg3859.15的克隆及功能分析

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苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因eg3859.15的克隆及功能分析

葡萄炭疽病菌T-DNA插入突变体的表型及致病性变异分析

中国植物病理学会2016年学术年会

作者：吴建圆周宗山冀志蕊张俊祥中国农业科学院果树研究所

苹果是我国第一大水果,2012年栽培面积达到220万hm,苹果产业已成为我国苹果主产区农民增收的支柱产业。近几年,苹果一种重要的新病害——苹果炭疽叶枯病,在我国山东、河南、江苏、安徽、河北、陕西、辽宁和山西等苹果主产区连年大发生,... 详细信息

苹果是我国第一大水果,2012年栽培面积达到220万hm,苹果产业已成为我国苹果主产区农民增收的支柱产业。近几年,苹果一种重要的新病害——苹果炭疽叶枯病,在我国山东、河南、江苏、安徽、河北、陕西、辽宁和山西等苹果主产区连年大发生,给苹果产业带来巨额损失。苹果炭疽叶枯病主要由胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)[有性世代:围小丛壳菌(GlomereUa cingulata)]引起。为了解析苹果炭疽叶枯病菌致病的分子机制,笔者所在课题组利用农杆菌介导(ATMT)方法,构建了苹果炭疽叶枯病菌强致病力菌株W16的T-DNA插入突变体库。以感病品种嘎拉为寄主,采用无伤接种方法,从T-DNA插入体库中筛选到一些致病性变异的突变体,其中突变体M1068丧失了致病能力。Southern杂交结果显示,该突变体的T-DNA插入为单拷贝插入,hiTAIL-PCR和Bridge-PCR结果显示,T-DNA的插入位点位于一个预测的基因(eg859.15)的第一个外显子上。通过对目的基因的上下游核苷酸序列设计引物,构建了潮霉素抗性基因靶标的敲除载体,然后通过ATMT技术进行同源重组,敲除eg859.15基因的敲除突变株。主要结果如下。(1)eg859.15基因DNA全长2568bp,包含5个内含子,编码652个氨基酸。(2)表型分析结果表明:eg859.15敲除突变体在PDA平板上呈现菌丝明显白化,生长速度约为野生型菌株的2/3。eg859.15敲除突变体不影响分生孢子的形成和萌发。致病性测验结果表明,eg859.15敲除突变体对苹果叶片及果实均无致病性。侵染过程观察结果表明,eg859.15敲除突变体不能形成附着胞,暗示其致病性的缺失与附着胞的形成相关。(3)eg859.15-egfp融合表达结构(construct)导入eg859.15敲除突变体基因组中,获得的转化子恢复了eg3859.15敲除突变体的表型。GFP信号观测结果表明,eg859.15主要在附着胞形成时表达(该结果仅由GFP信号强度判断)。初步证实基因eg859.15决定该病菌的附着胞的形成及致病性。

关键词：基因炭疽苹果致病突变体

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中国南方果树 2015年第5期44卷 23-27页

作者：张俊祥吴建圆冀志蕊迟福梅徐成楠周宗山中国农业科学院果树研究所辽宁兴城125100

胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的葡萄炭疽病是葡萄生产中的一种重要病害。本研究对从2 100个T-DNA插入突变体库中挑选的PDA培养特征变异较大的11株突变体进行表型和致病性分析,旨在为葡萄炭疽病菌产孢与致病基因网络调... 详细信息

胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的葡萄炭疽病是葡萄生产中的一种重要病害。本研究对从2 100个T-DNA插入突变体库中挑选的PDA培养特征变异较大的11株突变体进行表型和致病性分析,旨在为葡萄炭疽病菌产孢与致病基因网络调控研究奠定基础。结果表明,突变体M112、M247、M1288、M1325、M1386和M1430不能产生分生孢子,其余的5株突变体产孢量降低;突变体M247、M1288和M1325丧失了致病性;突变体M112、C1094、M1386和M2013突变体致病力增强。此外,突变体C1094孢子萌发率明显降低,其余4株产孢突变体的孢子萌发率与野生型菌株WS15无明显差异。

关键词：炭疽葡萄 T-DNA 突变体

苹果炭疽叶枯病菌致病力丧失突变体M744的T-DNA标记基因的克隆及功能分析

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苹果炭疽叶枯病菌致病力丧失突变体M744的T-DNA标记基因的克隆及...

中国植物保护学会2015年学术年会

作者：吴建圆周宗山冀志蕊迟福梅张俊祥中国农业科学院果树研究所

苹果炭疽叶枯病是由苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingulata;无性,Colletotrichum spp.)引起的,该病害在我国山东、河北、陕西、辽宁和山西等苹果主产区连年大发生,给苹果产业带来巨额损失。该病菌既为害叶片又为害果实,流行速度极快。... 详细信息

苹果炭疽叶枯病是由苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingulata;无性,Colletotrichum spp.)引起的,该病害在我国山东、河北、陕西、辽宁和山西等苹果主产区连年大发生,给苹果产业带来巨额损失。该病菌既为害叶片又为害果实,流行速度极快。叶片感病,初为黑色小点,逐渐扩展为边缘模糊的病斑,病斑在高温高湿条件迅速扩展形成大型枯死斑,导致叶片变黑枯死;果实染病,初为红褐色小点,后发展为圆形或近圆形直径1mm红褐色凹陷斑,果实的病斑量很大,单个果实上多达几百个病斑。目前,苹果炭疽叶枯病菌侵染苹果叶片的过程相对清楚,但该病原菌的致病机理研究较少,明确该病原菌的致病机理是控制该病害必要的基础性工作。前期,本实验室已经通过建立农杆菌介导的苹果炭疽叶枯病菌遗传转化技术体系,构建了苹果炭疽叶枯病菌菌株W16的T-DNA插入突变体库,并通过致病性测定筛选得到多株致病性变异的突变体。其中突变体M744丧失了致病能力,利用Southern杂交技术进行检测,结果显示突变体M744T-DNA插入为单拷贝插入。利用TAIL-PCR的方法扩增突变体M744侧翼序列,获得了T-DNA插入位点的左臂侧翼序列,其大小为358bp。通过与数据库中围小丛壳菌23基因组数据比对,得知T-DNA插入位点位于基因组数据库Scaffold序列。Fgenesh程序预测该基因是由3个外显子和2个内含子组成,转录起始位点与翻译起始密码子重合,PolyA信号与翻译终止密码子TAG重合。该基因由1 681个碱基组成,含有2段内含子,外显子碱基1 569个,编码氨基酸523个。该基因在丝状真菌中还未报道,在植物中该基因参与激素、脂质、金属离子、次生代谢产物和外源物质的运输,还参与植物与病原体间的相互作用和植物体内离子通道调控等重要的生理过程。推断该基因可能参与了苹果炭疽叶枯病菌内源物质的运输过程从而影响孢子萌发、侵染钉形成等相关过程,也可能参与对离子通道的调控影响毒素的释放过程进而影响病原菌的致病能力。

关键词：苹果基因 T-DNA 突变体致病

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苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因的筛选与鉴定

苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因的筛选与鉴定

农杆菌介导的苹果炭疽叶枯病菌遗传转化及插入突变体的筛选

中国植物保护学会2015年学术年会

作者：张俊祥吴建圆冀志蕊迟福梅周宗山中国农业科学院果树研究所

近几年,由围小从壳菌(Glomerella cingulata)侵染引起的苹果炭疽叶枯病,在我国山东、河北、陕西、辽宁和山西等苹果主产区大发生。该病菌除了为害叶片,也为害果实,给果农造成了巨大的经济损失。前期,本实验构建了苹果炭疽叶枯病菌菌株W1... 详细信息

近几年,由围小从壳菌(Glomerella cingulata)侵染引起的苹果炭疽叶枯病,在我国山东、河北、陕西、辽宁和山西等苹果主产区大发生。该病菌除了为害叶片,也为害果实,给果农造成了巨大的经济损失。前期,本实验构建了苹果炭疽叶枯病菌菌株W16的T-DNA插入突变体库。以感病品种嘎拉为寄主,采用无伤接种方法,从T-DNA插入体库中筛选到一些致病性变异的突变体,其中突变体M659丧失了致病能力。Southern杂交结果显示,该突变体的T-DNA插入为单拷贝插入,hiTAIL-PCR和Bridge-PCR结果显示,T-DNA的插入位点位于一个预测的基因(eg

关键词：基因炭疽苹果致病突变体

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基因组学与应用生物学 2014年第6期33卷 1261-1267页

作者：张俊祥吴建圆冀志蕊迟福梅蒋晓玲董庆龙周宗山中国农业科学院果树研究所兴城125100

围小丛壳菌,一种子囊菌真菌,能引起苹果炭疽叶枯病。本研究的目的是建立和优化农杆菌介导的苹果炭疽叶枯病菌遗传转化技术体系,获得产孢与致病性变异的突变体,为开展该菌的分生孢子形成机制、致病机理研究奠定基础。对影响转化效率的主... 详细信息

围小丛壳菌,一种子囊菌真菌,能引起苹果炭疽叶枯病。本研究的目的是建立和优化农杆菌介导的苹果炭疽叶枯病菌遗传转化技术体系,获得产孢与致病性变异的突变体,为开展该菌的分生孢子形成机制、致病机理研究奠定基础。对影响转化效率的主要因子进行单因子条件测验,对转化子进行PCR鉴定、绿色荧光观察和产孢及致病性分析。优化的遗传转化体系:预诱导4 h,培养介质滤纸,分生孢子浓度1伊106个/m L,农杆菌浓度OD600=0.3,乙酰丁香酮浓度50滋mol/m L,21℃,共培养时间24 h。利用这一体系,每106个分生孢子能产生350~400个转化子。通过转化子潮霉素抗性基因的PCR检测和荧光观察,证实潮霉素抗性基因和gfp基因已成功整合到该病菌基因组中。产孢和致病性检测结果显示,转化子M421、M755和M903致病力明显下降,转化子M285和M744丧失了致病能力,转化子M598和M856丧失了产孢能力和致病能力。本研究建立和优化了农杆菌介导的苹果炭疽叶枯病菌遗传转化技术体系,构建了该病菌的绿色荧光蛋白标记的突变体库,获得了产孢与致病性变异的转化子。

关键词：炭疽菌 GFP 分生孢子毒力农杆菌介导的遗传

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砀山酥梨TCP基因家族全基因组鉴定与分析

基因组学与应用生物学 2017年第2期36卷 766-773页

作者：冀志蕊董庆龙谷彦冰吴建圆迟福梅徐成楠张俊祥乔壮周宗山中国农业科学院果树研究所兴城125100

TCP蛋白是植物特有的转录因子家族之一,在植物生长和发育等多个过程起到重要作用。本研究利用生物信息学方法对砀山酥梨TCP基因家族成员、染色体定位、进化分析、亚组分类、保守域结构和保守元件进行了相关分析。结果显示,梨TCP基因家... 详细信息

TCP蛋白是植物特有的转录因子家族之一,在植物生长和发育等多个过程起到重要作用。本研究利用生物信息学方法对砀山酥梨TCP基因家族成员、染色体定位、进化分析、亚组分类、保守域结构和保守元件进行了相关分析。结果显示,梨TCP基因家族含有34个成员;进化分析表明,根据进化树拓扑结构将其分为两类:ClassⅠ和ClassⅡ,其中ClassⅡ可被分为CYC/TB1和CIN两个小组。结构域分析表明,梨TCP基因家族TCP结构域高度保守;保守元件分析表明,梨TCP基因家族包含5个保守元件:元件1是TCP保守域;元件2为R结构域,元件3、4和5为功能尚未鉴定的结构域,所有梨TCP蛋白都含有元件1,ClassⅡ组中CYC/TB1小组包含特异元件2。以上结果将为今后揭示梨TCP基因的功能提供重要的理论基础。

关键词：砀山酥梨 TCP基因家族全基因组鉴定进化分析

阿维链霉菌合成纳米硒的物理化学表征及其对枸杞病原真菌的抑菌活性

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生物工程学报 2025年

作者：张琪李亚妮周荣娟秦佳圆岳思君宁夏大学新华学院宁夏大学生命科学学院西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室

生物合成的纳米硒（selenium nanoparticles， SeNPs）具有独特的物理、化学和生物学特性，备受研究人员关注。为了开发将硒盐还原为SeNPs的菌种，本研究以阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）为研究对象，通过添加一定量的Na2SeO3... 详细信息

生物合成的纳米硒（selenium nanoparticles， SeNPs）具有独特的物理、化学和生物学特性，备受研究人员关注。为了开发将硒盐还原为SeNPs的菌种，本研究以阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）为研究对象，通过添加一定量的Na2SeO3，借助光学显微镜、扫描电镜（scanning electron microscope， SEM）、透射电镜（transmission electron microscope， TEM）、能量色散X射线能谱（energy dispersive spectrometer， EDS）分析、X射线衍射（X-ray diffraction， XRD）分析、傅里叶红外变换光谱（fourier transform infrared spectroscopy， FTIR）技术对菌体及合成的SeNPs进行物理化学表征分析，同时选用枸杞根腐病主要病原真菌-尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporium）对其抗菌活性进行研究。结果表明，阿维链霉菌可将Na2SeO3转化成SeNPs，能耐受300 mmol/L 的Na2SeO3，耐受性较高；阿维链霉菌可在细胞质中合成球形SeNPs，大部分直径在100 nm左右，并以菌丝断裂的方式释放；阿维链霉菌合成的SeNPs颗粒为非晶态，表面以C、Se为主，同时存在O、N等元素，-OH、C=O、C- N、C-H等官能团与SeNPs稳定性和生物活性密切相关；阿维链霉菌所产SeNPs对F. oxysporium有显著抑制活性，25 μmol/mL处理抑菌率可达77.61%，半数效应浓度(median effective concentration， EC50)为0.556 μmol/mL。总之，阿维链霉菌可耐受高Na2SeO3胁迫，同时还可介导合成SeNPs，合成的SeNPs颗粒具有良好的稳定性和抗菌活性，在SeNPs制备和枸杞根腐病防治方面具有潜在的应用价值。

关键词：阿维链霉菌纳米硒物理化学表征尖孢镰刀菌抑菌活性