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猪内源性反转录病毒的相关研究

猪内源性反转录病毒的相关研究

作者：吕茂民中国人民解放军军需大学

学位级别：硕士

猪作为实验动物已经在胚胎学、肿瘤学、免疫学以及人类多种疾病的研究中得到了广泛的应用。由于猪的心血管系统、消化系统、皮肤系统等与人类具有较大的相似性，一直是人类异种器官移植的首选供体，并且猪→人异种移植的研究也取得了令... 详细信息

猪作为实验动物已经在胚胎学、肿瘤学、免疫学以及人类多种疾病的研究中得到了广泛的应用。由于猪的心血管系统、消化系统、皮肤系统等与人类具有较大的相似性，一直是人类异种器官移植的首选供体，并且猪→人异种移植的研究也取得了令人鼓舞的进展。 1997年，Pateince等首次发现猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)在体外可以感染人的多种细胞，这一发现引起了人们对异种移植安全性的广泛关注，人们担心带有PERV的猪源细胞或器官一旦植入高度免疫抑制的人体内会否突破种间屏障造成人源大流行。因此，猪内源性病毒的研究与检测是猪→人异种器官移植、人用猪源生物制品等生物安全性的基础，也是进行高等级医学实验的前提。我国已经开展了猪→人异种器官移植的相关项目，但PERV的研究尚属空白。为了开发利用我国小型猪猪种资源并为实验用猪的病原安全性提供可靠的评价，我们开展了PERV的相关研究工作。我们结合国内开展的相关科研项目进行了PERV的前期研究工作，现分述如下： ***特异性检测方法的建立及对猪源传代细胞系的检测。根据已发表的PERV相关序列，合成了6对引物，应用PCR的方法对4株猪源细胞DNA样品及COS-7细胞DNA对照样品进行检测并对反应条件进行了优化，结果表明此方法能特异性地检测出PERV前病毒的存在情况：应用RT-PCR的方法对5种细胞的RNA样品进行检测PERV表达情况，结果显示所建立的RT-PCR方法也是特异的。PERV特异性检测方法的建立为我们后面的研究工作打下了基础。 2．中华实验小型猪中内源性反转录病毒的存在与表达。应用PCR和RT-PCR的方法，对来源于中华实验小型猪外周血淋巴细胞(PBL)的DNA和RNA样品进行了系统的检测。结果表明，在所有被检样品中均有PERV前病毒的存在，且存在于基因组中的前病毒均能以mRNA的形式进行表达。由于囊膜基回具有一定的变异性，根据env基因的不同通常将PERV分为三种个问的亚到，即 PERV－A、PERV－B和 PERV－C。应用分型引物对被检样品进行了分型检测，结果显示在所有的样品中均有A和B亚型的存在与表达，只有两例检出了C亚型前病毒的存在;所有样品中均未检出PERV（的表达。本研究对我国特有小型猪的实验动物化具有重要意义。 3．中华实验小型猪来源的PERV囊膜基因的克隆与同源序列比较。应用*** 的方法从中华实验小型猪外周血淋巴细胞RNA样品中钓取了PERVenv基因，并克隆至pGEM＊载体。序列测定表明，所克隆的env基因含有2004个核着酸。经序列分析证实，该片段含有一个完整的读码框架，长为1983hp，编码660个氨基酸，为PE RVRV－A亚型。同源序列比较．显小，该基因与法系大白猪来源的P＊RV叭1的囊膜基因具有97％的序列同源。他与欧洲小型猪来源的PERV囊膜基因具有82％的序列同源性。序列测定的结果为进一步从分于水平研究PERV奠定了基础。 4．猪内源性反转录病毒感染人HEK293细胞模型的建立。为了证实PERV对人源细胞的感染，首先，将含有neo基因的质粒pIRESneo通过脂质体转染了 293细胞，并培育了 G418抗性的 HEK293细胞。然后应用 PK15和 G418抗。叮293细胞共培养、经G418加压筛选的方法成功地建立了PERV感染HEK293细胞的模型。这一感染模型的成功建立，为今后的研究工作提供了一个极好的实验平台，也有利于对PERV的病原安全性作进一步的评价。综上所述，本课题的研究工作己具有了良好基础，为进一步深入研究PERV创造了条件，也为进行PERV安全性评价提供了依据。

关键词：猪内源性反转录病毒检测中华实验小型猪存在与表达囊膜基因克隆转染 G418抗性 HEK293细胞细胞模型感染

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血液制品的现状与展望

生物工程学报 2011年第5期27卷 730-746页

作者：王卓赵雄吕茂民章金刚军事医学科学院野战输血研究所北京100850

血液制品特指血浆蛋白制品和相应的重组制品。根据临床应用的效能,血液制品可以分为白蛋白类、免疫球蛋白类、凝血因子类和微量蛋白制品等不同种类。血浆白蛋白制品是最早应用于战伤救治的血液制品,高纯白蛋白、重组白蛋白以及重组白蛋... 详细信息

血液制品特指血浆蛋白制品和相应的重组制品。根据临床应用的效能,血液制品可以分为白蛋白类、免疫球蛋白类、凝血因子类和微量蛋白制品等不同种类。血浆白蛋白制品是最早应用于战伤救治的血液制品,高纯白蛋白、重组白蛋白以及重组白蛋白融合药物的研发和上市开创了血液制品的新局面。肌肉注射用免疫球蛋白因其制备工艺相对简单,使用方便,价格低廉且不良反应可以接受而一直在临床实践中应用;静脉注射用免疫球蛋白随着新的适应症不断发现,其应用范围越来越广;皮下注射用免疫球蛋白的出现使免疫球蛋白的使用更加方便,已经成为静脉注射用免疫球蛋白安全有效的替代品;针对特定病原体的特异性免疫球蛋白在临床上更具有不可替代的作用。凝血因子和重组凝血因子类制品主要用于相应的先天性遗传性缺陷患者,纤维蛋白原、因子Ⅶ、因子Ⅷ、von Willebrand因子复合物、因子Ⅸ和凝血酶原复合物、因子Ⅺ、因子ⅩⅢ等制品的应用取得了良好的治疗效果。因子Ⅶa和活化凝血酶原复合物对于治疗产生凝血因子抑制物的血友病病人具有十分明显的效果。纤维蛋白原类制品和凝血酶在外科止血方面发挥着重要的作用。多种微量血浆蛋白制品已经上市,如蛋白C、抗凝血酶、α1-抗胰蛋白酶和组织纤溶酶原激活剂等。部分微量血浆蛋白制品也在研发和临床试验过程中,如C1-抑制剂、补体系统Ⅰ因子、α2-巨球蛋白、血清胆碱酯酶、铜蓝蛋白以及纤维结合蛋白等。尽管多种重组血浆蛋白制品已经上市,血浆来源的制品仍将具有其不可替代的特殊地位,血浆蛋白新品种的研发仍是热点。目前,我国血液制品的研发与国外存在着较大的差距,我国血液制品企业面临着机遇与挑战。

关键词：血液制品血浆蛋白重组血浆蛋白白蛋白免疫球蛋白凝血因子

凝血因子Ⅶ基因表达载体的构建及其在BHK细胞中的表达

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中国生物工程杂志 2005年第1期25卷 44-47页

作者：吕茂民王娜王栋于群章金刚军事医学科学院野战输血研究所北京100850

凝血因子Ⅶ是凝血块形成的起始关键分子之一,它对外源性凝血途径的启动具有重要的作用。为表达具有促凝活性的重组人凝血因子Ⅶ,通过PCR的方法从质粒pUC-FⅦ中扩增人凝血因子ⅦcDNA,并将其定向克隆入真核表达载体pIRESneo中,构建重组表... 详细信息

凝血因子Ⅶ是凝血块形成的起始关键分子之一,它对外源性凝血途径的启动具有重要的作用。为表达具有促凝活性的重组人凝血因子Ⅶ,通过PCR的方法从质粒pUC-FⅦ中扩增人凝血因子ⅦcDNA,并将其定向克隆入真核表达载体pIRESneo中,构建重组表达载体pIRES-FⅦ,测序正确后用脂质体介导的方法转染BHK-21细胞,经G418加压筛选、细胞有限稀释等方法获得克隆细胞株,收集无皿清培养上清,进行SDS-PAGE、Western blot和活性鉴定。结果成功构建了重组表达载体pIRES-FⅦ,实现了其在BHK-21细胞中的表达,且表达产物具有促凝活性。重组人凝血因子Ⅶ在哺乳动物细胞中的成功表达,为整体止血剂的研究奠定了基础。

关键词：重组人凝血因子Ⅶ 表达载体 BHK细胞基因表达止血剂

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重组人凝血因子Ⅶ的纯化与鉴定

中国输血杂志 2010年第4期23卷 252-255页

作者：吕茂民王卓冯晶晶章金刚军事医学科学院野战输血研究所北京100850

目的建立重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ)的纯化方法。方法首先将制备并纯化的单克隆抗体与CNBr-Sepharose 6B Fast Flow介质偶联,制备单克隆抗体亲和层析柱,并用rhFⅦ标准品验证层析柱的层析效果;采用DE-AE-Sephadex A-50吸附细胞表达的上清,... 详细信息

目的建立重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ)的纯化方法。方法首先将制备并纯化的单克隆抗体与CNBr-Sepharose 6B Fast Flow介质偶联,制备单克隆抗体亲和层析柱,并用rhFⅦ标准品验证层析柱的层析效果;采用DE-AE-Sephadex A-50吸附细胞表达的上清,对吸附产物用Sephadex G-25脱盐柱做脱盐处理;然后用单克隆抗体亲和层析柱做亲和层析;通过SDS-PAGE、Western Blot等试验测定纯化产物的纯度;通过凝血酶原时间(PT)测定纯化产物的促凝活性。结果制备出rhFⅦ单克隆抗体亲和层析介质;细胞表达产物经DEAE-Sephadex A-50、Sephadex G-25脱盐和亲和层析纯化后,经SDS-PAGE鉴定获得了分子量为50kD的单一蛋白洗脱峰;纯化所获得的重组蛋白具有促凝活性,促凝时间(DT)为52s。结论建立了纯化rhⅦ的亲和层析方法 ,为rhFⅦ的研制奠定了基础。

关键词：亲和层析重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ) 纯化单克隆抗体

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血液代用品样品中牛白血病病毒的检测

中国兽医杂志 2008年第6期44卷 89-91页

作者：史利军邵长利吕茂民章金刚军事医学科学院野战输血研究所

牛白血病是由牛白血病病毒(bovine leukemia virus,BLV)引起的牛的一种慢性肿瘤性疾病。其特征为淋巴样细胞恶性增生,进行性恶病质和发病后的高死亡率。此病早在19世纪末就被发现,但直到1969年才由美国的Miller从病牛外周血液淋巴细胞... 详细信息

牛白血病是由牛白血病病毒(bovine leukemia virus,BLV)引起的牛的一种慢性肿瘤性疾病。其特征为淋巴样细胞恶性增生,进行性恶病质和发病后的高死亡率。此病早在19世纪末就被发现,但直到1969年才由美国的Miller从病牛外周血液淋巴细胞中分离到病毒。目前此病几乎遍及全世界各养牛国家,亚洲的日本发生也较多。此病在我国于1974年首次发现于上海,目前本病有逐渐扩大蔓延的趋势。在某些牛群中血清阳性率已达30%－50%,已成为牛的重要传染病之一。牛源的血液代用品是生物医学研究的重要方向,具有广阔的应用前景,所以此类代用品病毒安全性检测就日益受到关注。[第一段]

关键词：牛白血病病毒血液代用品安全性检测样品淋巴细胞 virus 肿瘤性疾病 19世纪末

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凝血因子与创伤止血

军事医学 2015年第3期39卷 211-215页

作者：吕茂民王方赵雄章金刚军事医学科学院野战输血研究所北京100850

凝血因子参与机体凝血过程的内、外源性途径,与机体抗凝系统相互协调,两者的动态平衡维持着体内血液正常的生理状态。该文从分子结构、理化特性、生理功能等方面对参与创伤止血相关的凝血因子进行了详述,同时,对其在创伤出血控制、凝血... 详细信息

凝血因子参与机体凝血过程的内、外源性途径,与机体抗凝系统相互协调,两者的动态平衡维持着体内血液正常的生理状态。该文从分子结构、理化特性、生理功能等方面对参与创伤止血相关的凝血因子进行了详述,同时,对其在创伤出血控制、凝血方面发挥的重要作用及相关凝血因子类制品的研究进展、使用现状进行了综述,以期为凝血因子类药物的研发及应用提供借鉴。

关键词：凝血因子创伤止血

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鹅副粘病毒病

预防兽医学进展 2000年第4期2卷 59-61页

作者：吕茂民刘全中国人民解放军需大学兽医学院长春

异种器官移植中PERV病原安全性的研究进展

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国外医学（病毒学分册） 2002年第1期9卷 12-15页

作者：吕茂民章金刚军事医学科学院输血医学研究所，北京100850 北京市海淀区平路27号九所三室

猪内源性反转录病毒 (porcine endogenous retrovirus,PERV)是指以前病毒 DNA形式整合进宿主细胞基因组中 ,并随细胞染色体复制而复制的反转录病毒。由于 PERV在体外可以感染人的多种细胞 ,这引起了人们对猪 -人异种移植病原安全性的广... 详细信息

猪内源性反转录病毒 (porcine endogenous retrovirus,PERV)是指以前病毒 DNA形式整合进宿主细胞基因组中 ,并随细胞染色体复制而复制的反转录病毒。由于 PERV在体外可以感染人的多种细胞 ,这引起了人们对猪 -人异种移植病原安全性的广泛关注。本文从 PERV的生物学特性。

关键词：异种器官移植 PERV 病原安全性基因组结构

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人血浆凝血因子Ⅷ柱纯化前处理方法的比较

军事医学 2015年第3期39卷 199-202页

作者：王方吕茂民赵雄余蓉章金刚四川大学华西药学院微生物与生化药学教研室成都610041 军事医学科学院野战输血研究所北京100850

目的对人血浆凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅧ,FⅧ)制备过程中4种柱纯化前处理方法进行比较并分析其优缺点,为血源FⅧ的纯化制备提供借鉴与参考。方法冷沉淀经Tris溶解后的上清,分别用甘氨酸沉淀法、PEG沉淀法、酸沉淀法和氢氧化铝凝... 详细信息

目的对人血浆凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅧ,FⅧ)制备过程中4种柱纯化前处理方法进行比较并分析其优缺点,为血源FⅧ的纯化制备提供借鉴与参考。方法冷沉淀经Tris溶解后的上清,分别用甘氨酸沉淀法、PEG沉淀法、酸沉淀法和氢氧化铝凝胶吸附法处理;用活化部分凝血活酶(APTT)法测定样品上清中FⅧ活性,计算总活性回收率和样品的比活性,用非还原性SDS-PAGE电泳比较去除杂蛋白的效果。结果 4种处理方法中,甘氨酸沉淀法总活性回收率最高[(94.00±7.60)%],其次是酸性沉淀法[(89.47±2.60)%]、PEG沉淀法[(80.92±9.67)%],氢氧化铝吸附法的总活性回收率最低[(78.65±7.52)%];甘氨酸沉淀法与PEG沉淀法去除杂蛋白的效果优于酸性沉淀法和氢氧化铝吸附法;经4种不同方法处理后,甘氨酸沉淀法所得样品中FⅧ比活最高[(0.6856±0.1258)IU/mg],其次是PEG沉淀法[(0.5773±0.0787)IU/mg]、酸性沉淀法[(0.3885±0.0301)IU/mg],氢氧化铝吸附法所得样品比活最低[(0.2879±0.0472)IU/mg]。结论在上述方法中,甘氨酸沉淀法和PEG沉淀法的总体效果较佳,且因后者操作更加简便、快捷,在实际生产过程中采用PEG沉淀法较为合适。

关键词：人凝血因子Ⅷ 冷沉淀柱纯化前处理