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禾谷镰刀菌醛脱氢酶(ALDH)基因敲除突变体的转录组分析

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南方农业学报 2024年第3期55卷 733-744页

作者：唐磊翟焕趁葛锦雯张帅兵吕扬勇魏闪马平安胡元森河南工业大学生物工程学院河南郑州450001

【目的】对野生型PH-1菌株和醛脱氢酶(ALDH)基因FGSG_04194敲除突变体(ΔFg04194)进行转录组测序,分析禾谷镰刀菌ALDH调控菌丝生长和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)生成情况,为深入探究禾谷镰刀菌ALDH的生物学功能、DON生成机制及致病机理提... 详细信息

【目的】对野生型PH-1菌株和醛脱氢酶(ALDH)基因FGSG_04194敲除突变体(ΔFg04194)进行转录组测序,分析禾谷镰刀菌ALDH调控菌丝生长和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)生成情况,为深入探究禾谷镰刀菌ALDH的生物学功能、DON生成机制及致病机理提供了理论依据。【方法】接种禾谷镰刀菌野生型PH-1、ΔFg04194突变体和基因回补突变体(ΔFg04194-C)菌株至CM培养基和小麦基质中,分析FGSG_04194基因对菌丝生长和DON生成的影响。利用高通量转录组测序技术对野生型PH-1菌株和ΔFg04194突变菌株在CM培养基中培养72 h的菌丝进行转录组测序,对筛选出的差异表达基因(DEGs)进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,利用实时荧光定量PCR对转录组测序结果进行验证。【结果】ΔFg04194突变体的菌落直径和生成的DON含量较野生型PH-1和ΔFg04194-C突变体菌株显著减少(P<0.05,下同)。野生型PH-1和ΔFg04194突变体转录组原始数据经过滤后获得34.9 Gb Clean data,共鉴定出329个DEGs,其中263个基因表达显著上调,66个基因表达显著下调。GO功能注释结果显示,DEGs显著富集在质膜成分、碳水化合物代谢和物质转运过程等条目上。KEGG信号通路富集分析显示,DEGs显著富集在碳水化合物代谢通路、氨基酸代谢通路、脂质代谢、能量代谢、生物降解代谢通路、细胞生长和死亡相关途径、信号转导途径等。将FGSG_04194基因调控下有代表性的DEGs分成五大类:几丁质合成相关的基因、跨膜转运蛋白相关的基因、转录因子相关基因、脂质代谢相关基因和能量代谢相关的基因。ΔFg04194突变体的ATP含量显著高于野生型PH-1和ΔFg04194-C突变体。运用实时荧光定量PCR检测7个DEGs的表达情况,其结果与转录组测序结果基本一致。【结论】FGSG_04194影响禾谷镰刀菌的菌丝生长和DON生成,并在ATP生成中起负调控作用,其机制可能与调控转录因子的表达、调控脂类代谢、氨基酸代谢和能量代谢等通路有关。

关键词：禾谷镰刀菌醛脱氢酶转录组测序差异表达基因

莱姆病螺旋体端粒解离酶的表达纯化及其晶体衍射分析

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2024年第2期52卷 1-11页

作者：胡元森王远吕扬勇黄亮张帅兵李娜河南工业大学生物工程学院河南郑州450001

【目的】对莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)端粒解离酶(telomere resolvase,ResT)进行原核可溶性表达纯化,并筛选高衍射度的ResT-DNA复合物晶体,为探究ResT-DNA复合物的结构和功能奠定基础。【方法】合成pET28 b-ResT表达质粒,构建... 详细信息

【目的】对莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)端粒解离酶(telomere resolvase,ResT)进行原核可溶性表达纯化,并筛选高衍射度的ResT-DNA复合物晶体,为探究ResT-DNA复合物的结构和功能奠定基础。【方法】合成pET28 b-ResT表达质粒,构建原核表达载体pSUMO-ResT,分析ResT可溶性蛋白在BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21 Gold(DE3)pLysS、BL21 Codon Plus(DE3)、Rosetta(DE3)和Rosetta(DE3)pLysS中的表达量,获得最优的ResT原核表达菌株。基于AlphaFold预测的ResT蛋白模型,利用定点突变及ResT可溶性蛋白表达分析,获得高效可溶性表达ResT突变体。经Ni-NTA亲和层析、HiTrap Heparin HP亲和层析及分子筛层析对ResT突变体ResT(W94H)进行蛋白纯化。利用EMAS检测ResT(W94H)与DNA的结合能力。使用蛋白晶体接种(seeding)和交叉接种(cross-seeding)方法,利用多种商业化结晶试剂盒筛选并优化ResT-DNA复合物的结晶条件,对复合物晶体进行X射线衍射分析。【结果】BL21 Gold(DE3)pLysS菌株是ResT最佳的高效可溶性表达菌株,W94H突变体比野生型具有更强的可溶性表达。获得了高纯度(95%)且高质量浓度(15 mg/mL)的ResT(W94H),其能够与底物DNA形成稳定的ResT-DNA复合物。在18℃下,ResT-DNA最佳结晶条件是:PEG3350150 g/L、二甲苯二酸钠0.1 mol/L(pH 6.6)、NaCl 0.15 mol/L,ResT-DNA晶体分辨率最高为3.52,晶体空间群为P4。【结论】得到了高纯度ResT(W94H)蛋白,获得了ResT-DNA复合物晶体。

关键词：莱姆病螺旋体端粒解离酶原核表达和纯化蛋白结晶 X-射线衍射

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AnHog1基因缺失对黑曲霉中赭曲霉毒素A生物合成的影响

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河南工业大学学报（自然科学版） 2023年第6期44卷 76-82页

作者：张艺格魏闪吕扬勇翟焕趁张帅兵胡元森河南工业大学生物工程学院河南郑州450001

黑曲霉菌株能够产生强致癌的赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA),对食品安全和人类健康存在巨大隐患。为深入研究OTA生物合成调控机理,构建了黑曲霉AnHog1基因缺失菌株,通过高效液相色谱-荧光检测器检测该基因对OTA合成的影响,采用荧光定量... 详细信息

黑曲霉菌株能够产生强致癌的赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA),对食品安全和人类健康存在巨大隐患。为深入研究OTA生物合成调控机理,构建了黑曲霉AnHog1基因缺失菌株,通过高效液相色谱-荧光检测器检测该基因对OTA合成的影响,采用荧光定量PCR技术探究该基因缺失对OTA生物合成簇内基因表达水平的影响,并检测对过氧化氢(H_(2)O_(2))耐受性与活性氧(ROS)水平的影响。结果表明:AnHog1基因缺失不影响黑曲霉生长及产孢,但显著抑制OTA生物合成,OTA含量下降了40.8%;敲除AnHog1基因后,与OTA合成基因簇相关的基因pks、p450、nrps、hal和bzip的表达水平分别下调了64.19%、25.82%、18.88%、51.31%和48.92%;在H_(2)O_(2)胁迫条件下,AnHog1基因缺失菌株对H2O2敏感性增加,且菌丝体内ROS水平升高。AnHog1基因缺失后可能通过抑制OTA合成基因的表达和破坏氧化还原平衡抑制OTA生物合成,研究结果为挖掘真菌防控新靶标提供科学依据。

关键词：黑曲霉赭曲霉毒素A AnHog1 OTA合成基因簇氧化还原平衡

pyrG基因缺失对黑曲霉中赭曲霉毒素A生物合成的影响

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河南工业大学学报（自然科学版） 2022年第4期43卷 1-8页

作者：胡朝江张艺格张智慧牛志鹏吕扬勇翟焕趁魏闪胡元森河南工业大学生物工程学院河南郑州450001

黑曲霉在食品工业中广泛应用,但近年来发现该菌群可产生赭曲霉毒素A(OTA)等强致癌真菌毒素,对食品安全造成严重威胁。为了研究黑曲霉中OTA合成调控机理,构建了乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因pyrG缺失菌株及回补菌株,利用HPLC-FLD检测该... 详细信息

黑曲霉在食品工业中广泛应用,但近年来发现该菌群可产生赭曲霉毒素A(OTA)等强致癌真菌毒素,对食品安全造成严重威胁。为了研究黑曲霉中OTA合成调控机理,构建了乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因pyrG缺失菌株及回补菌株,利用HPLC-FLD检测该基因对OTA生物合成的影响,通过添加不同浓度尿嘧啶核苷及荧光定量PCR,初步探索该基因调控OTA合成的机理,并检测玉米粒上该基因缺失菌株中OTA含量的变化。结果表明:与野生型菌株及回补菌株相比,pyrG基因缺失菌株OTA含量分别降低77.8%和75.7%;该基因调控OTA合成不依赖尿嘧啶核苷的浓度;与野生型菌株相比,pyrG基因缺失菌株OTA合成基因簇中基因pks、p450、nrps、hal和bZIP基因的表达水平分别下调52.0%、36.0%、84.0%、46.0%、74.0%,与回补菌株相比,分别下调55.7%、42.1%、85.1%、50.3%、76.0%;pyrG基因缺失后导致玉米粒上的黑曲霉菌株几乎不产生OTA。pyrG基因缺失影响黑曲霉中OTA合成基因pks、p450、nrps、hal及bZIP的表达,从而降低了OTA的合成水平。

关键词：黑曲霉赭曲霉毒素A pyrG OTA合成基因簇玉米粒

谷氨酸棒杆菌产L-苏氨酸重组子的构建及发酵初步研究

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谷氨酸棒杆菌产L-苏氨酸重组子的构建及发酵初步研究

作者：吕扬勇华南理工大学

学位级别：硕士

L-苏氨酸是人体必需的八种氨基酸之一,已被广泛应用于食品、饲料、医药等方面。由于大肠杆菌生长迅速等原因使其成为苏氨酸的生产菌种,谷氨酸棒杆菌也可以用来生产苏氨酸。随着谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC 13032基因组测序的完成,氨基酸... 详细信息

L-苏氨酸是人体必需的八种氨基酸之一,已被广泛应用于食品、饲料、医药等方面。由于大肠杆菌生长迅速等原因使其成为苏氨酸的生产菌种,谷氨酸棒杆菌也可以用来生产苏氨酸。随着谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC 13032基因组测序的完成,氨基酸合成相关基因调控机理的清晰,以及谷氨酸棒杆菌基因操作载体系统的完善,使得通过分子生物学手段对谷氨酸棒杆菌进行相关改造来达到育种的想法变成现实。本文以一株具有苏氨酸结构类似物抗性菌株R102（AHVr,即解除了苏氨酸过量对高丝氨酸脱氢酶的反馈抑制）为出发菌株,主要研究内容及结果概括如下: （1）建立DNFB柱前衍生法测定发酵液中苏氨酸含量,并确定该方法的适宜条件。（2）利用重叠延伸PCR及谷氨酸棒杆菌基因敲除载体pk18mobsacB构建了metX、dapA基因缺失菌株R102ΔmetX、R102ΔdapA以及R102ΔmetXΔdapA。以dnaE（编码DNA聚合酶）为内参基因,通过实时荧光定量PCR对基因敲除的效果进行了验证,并对重组菌进行了初步发酵试验。结果表明发酵72小时后三株重组菌的苏氨酸产量分别为2.58g/L、2.38 g/L、3.01 g/L,比原始菌株分别提高了42.5%、31.5%、66.3%。（3）在R102ΔmetXΔdapA基础上利用谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pEC-T18mob2过量表达了苏氨酸操纵子及苏氨酸胞外运输基因hom-thrB（O）、thrE（E）,构建了单个基因过量表达菌株R102ΔmetXΔdapA（pEC-O）、R102ΔmetXΔdapA（pEC- E）。同时对两个基因进行了两种串联方式进行表达,A:将两个基因置于同一个启动子之下构建了R102ΔmetXΔdapA（pEC-O-E）、R102ΔmetXΔdapA（pEC-E-O）;B:分别在每一个基因前面加入lac启动子构建R102ΔmetXΔdapA（pEC-p-O-p-E）,简写为R102ΔΔ（pEC-Box）。通过实时荧光定量PCR对基因过量表达的效果进行了验证,重组菌初步发酵结果显示苏氨酸产量为3.35g/L。（4）对产酸能力较好的重组菌R102ΔΔ（pEC-Box）的苏氨酸发酵培养基进行了响应面的优化。首先利用Plackett-Burma设计筛选对苏氨酸产量影响显著的因子:葡萄糖、硫酸铵、酶解酪素,继而采用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,并结合中心组合实验和响应面分析对3个显著性因素进行分析,得到优化的发酵培养基,苏氨酸产量为3.8g/L,比未优化前提高了13%。

关键词：谷氨酸棒杆菌基因敲除过量表达响应面苏氨酸操纵子

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重组谷氨酸棒杆菌产苏氨酸发酵培养基的优化

食品与发酵工业 2010年第12期36卷 25-30页

作者：吕扬勇伍展红郑穗平华南理工大学生物科学与工程学院硕士研究生广东广州510006

通过基因敲除构建了蛋氨酸合成途径关键酶基因metX缺失的重组谷氨酸棒杆菌R102ΔmetX。采用部分因子实验设计考察发酵培养基中各组分对重组菌产苏氨酸的影响。结果表明,葡萄糖、酵母粉和酶解酪素对产苏氨酸影响显著。继而采用最陡爬坡... 详细信息

通过基因敲除构建了蛋氨酸合成途径关键酶基因metX缺失的重组谷氨酸棒杆菌R102ΔmetX。采用部分因子实验设计考察发酵培养基中各组分对重组菌产苏氨酸的影响。结果表明,葡萄糖、酵母粉和酶解酪素对产苏氨酸影响显著。继而采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,并结合中心组合实验和响应面对3个显著性因素进行分析,得到优化的发酵培养基组成:葡萄糖50.78 g/L,酵母粉6 g/L,酶解酪素0.99g/L,生物素80μg/L,VB1 2mg/L,CaCO3 20 g/L,(NH4)2SO4 15.15 g/L,MgSO4.7H2O 0.5 g/L,KH2PO4 0.5g/L,K2HPO4 0.5g/L,Fe-SO4.7H2O 0.02g/L,MnSO4.7H2O 0.02g/L,接种量8%。采用该优化培养基,供试菌株的胞外苏氨酸浓度为3.35g/L,较优化前提高了30%。

关键词：谷氨酸棒杆菌 L-苏氨酸响应面培养基优化

新工科背景下以学生发展为中心的生物工程专业实践教学改革研究

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中国科技期刊数据库科研 2022年第12期 160-163页

作者：黄亮屈建航胡元森刘娜吕扬勇河南工业大学生物工程学院河南郑州450001

为支撑服务创新驱动发展,促进工程人才的培养,教育部提出了“新工科”概念并发布了《教育部高等教育司关于开展新工科研究与实践的通知》。实践教学是生物工程专业人才培养目标达成的重要保障。通过分析新工科背景下实践教学与毕业要求... 详细信息

为支撑服务创新驱动发展,促进工程人才的培养,教育部提出了“新工科”概念并发布了《教育部高等教育司关于开展新工科研究与实践的通知》。实践教学是生物工程专业人才培养目标达成的重要保障。通过分析新工科背景下实践教学与毕业要求之间存在的支撑问题,改革实践教学内容,有效衔接专业核心课程间的实践教学环节,打造完备的专业实践教学链,有助于提高学生实践创新能力和促进工科专业应用型人才的培养。

关键词：新工科生物工程实践教学

课程思政在药物化学理论教学中的应用研究与实践

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中文科技期刊数据库（全文版）教育科学 2022年第7期 125-128页

作者：段二珍屈建航吴兴泉黄亮吕扬勇河南工业大学生物工程学院河南郑州450000

在大思政背景下,药物化学围绕立德树人这一根本任务开展教学研究与实践。为了能够提高药物化学理论教学中课程思政教学的效果。本文从课程思政的必要性,课程思政目标,课程思政教学设计及策略和课程思政教学成效四个方面探讨了在药物化... 详细信息

在大思政背景下,药物化学围绕立德树人这一根本任务开展教学研究与实践。为了能够提高药物化学理论教学中课程思政教学的效果。本文从课程思政的必要性,课程思政目标,课程思政教学设计及策略和课程思政教学成效四个方面探讨了在药物化学理论教学中融入课程思政的心得和不足,并就如何进一步改善课程思政的融入效果提出了几点几建议,希望为以后教学提供借鉴参考。

关键词：药物化学课程思政教学改革学习效能

抗菌肽Hst5抑制串珠镰刀菌生长及作用机制研究

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食品安全质量检测学报 2022年第22期13卷 7174-7182页

作者：辛艳丽王静杨浩杰吕昂张威魏闪胡元森吕扬勇河南工业大学生物工程学院郑州450000

目的研究抗菌肽Hst5对串珠镰刀菌的抑制作用,探究其作用机制。方法通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、钙荧光白、碘化丙啶、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚、线粒体膜电位荧光探针JC-1和2,7-二氯荧光素二乙酸酯等分析不同浓度Hst5处理后的... 详细信息

目的研究抗菌肽Hst5对串珠镰刀菌的抑制作用,探究其作用机制。方法通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、钙荧光白、碘化丙啶、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚、线粒体膜电位荧光探针JC-1和2,7-二氯荧光素二乙酸酯等分析不同浓度Hst5处理后的串珠镰刀菌细胞超微结构及胞内氧化还原状态的改变。结果Hst5处理导致串珠镰刀菌孢子细胞壁破损、细胞膜通透性改变、细胞核受损、细胞器聚集等一系列现象;同时造成线粒体膜电位下降、琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶酶活性降低及胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高。结论Hst5抑制串珠镰刀菌生长是多方面协同作用的结果,抗菌肽破坏了细胞壁的完整性和细胞膜的通透性,同时造成线粒体功能紊乱进而导致胞内ROS水平升高、细胞核DNA出现片段化,最终减弱了串珠镰刀菌在玉米和西红柿中的致病性。本研究为防治串珠镰刀菌提供了新的途径,为制备新的抗真菌剂奠定一定的理论基础。

关键词：抗菌肽串珠镰刀菌 Hst5 抑制机制